研究阶段	产品名称	产品规格	储存
定形内胚层(DE)阶段	基础培养基1	100mL	-20℃，12个月
定形内胚层(DE)阶段	补充剂A	1100μL	-20℃，6个月
中后肠球体（MH）分化阶段	基础培养基1	100mL	-20℃，12个月
	补充剂B	640μL	-20℃，6个月
	补充剂C	640μL	-20℃，6个月
肠道（3D）类器官阶段	基础培养基2	100mL	-20℃，12个月
肠道（3D）类器官阶段	补充剂D	2mL	-20℃，6个月

其他相关试剂

产品名称	来源	货号
hESC/iPSC细胞培养试剂盒	IMMOCELL	IMC-014
干细胞基质胶	IMMOCELL	IMV-A026
DMEM/F-12	IMMOCELL	IMC-205
HEPES	IMMOCELL	IMC-407-100 mL
低生长因子基质胶	IMMOCELL	IMV-A019

实验内容与方法

1、基质胶准备

（1）在铺板hPSC细胞时，要使用干细胞基质胶，基质胶按产品各批次的操作说明进行分装，后续基质胶在4℃下解冻，与含15mM HEPEs的DMEM/F12均匀混合，铺板，备用。

表1. 培养器皿包被的推荐基质体积

组织培养处理的培养器皿	稀释基质的体积
24孔板	250 µL/孔
12孔板	500 µL/孔
6孔板	1 mL/孔
100 mm 培养皿	6 mL/皿
T-25 cm² 培养瓶	3 mL/瓶
T-75 cm² 培养瓶	8 mL/瓶

2、内胚层（DE）培养基的制备

（1）在第 0 天，准备第 0、1 和 2 天所需的 DE 培养基（基础培养基1 + 补充剂A）体积（1.7 mL/孔）。

（2）以制备 2 mL DE 培养基为例：

在冰上解冻补充剂A。充分混合。

注：如果不立即使用，请分装并在 -20°C 下储存。不要超过补充剂的保质期。解冻等分试剂后，立即使用，请勿重新冷冻。

在室温 (15 - 25°C) 解冻1h或在4°C冰箱过夜解冻整瓶基础培养基1，充分混合。

注：如果不立即使用，可在 2 - 8°C 下储存长达 2 个月。或者，分装并在 -20°C 下储存。不要超过标签上标明的有效期。解冻等分试样后，立即使用或在 2 - 8°C 下储存长达 2 周，请勿重新冷冻。

将 20 μL 补充剂A加入 1.98 mL 冷的 (2 - 8°C)基础培养基1中。充分混合后，储存在 2 - 8°C。

3、分化为内胚层细胞（DE）（以24孔板为例）

（1）第 0 天：预复温 (37°C) 第 0 天所需的 DE 培养基体积 (0.7 mL/孔)。将剩余的 DE 培养基储存在 2 - 8°C。

从 hPSC细胞中吸去完培。将倾斜的培养板每孔沿孔壁逐滴加入 0.7 mL DE 培养基。在 37°C、5% CO₂ 和 95% 湿度下孵育最多 24 小时。

（2）第 1 天：预复温 (37°C) 第 1 天使用所需的 DE 培养基体积 (0.5 mL/孔)。将剩余的 DE 培养基储存在 2 - 8°C。从细胞中吸去培养基。将倾斜的培养板每孔沿孔壁逐滴加入 0.5 mL DE 培养基。在 37°C、5% CO₂ 和 95% 湿度下孵育 24 小时。

（3）第 2 天：预复温(37°C) 剩余的 DE 培养基。从细胞中吸去培养基。将倾斜的培养板每孔沿孔壁逐滴加入 0.5 mL DE 培养基。在 37°C、5% CO₂ 和 95% 湿度下孵育 24 小时。

（4）第 3 天：细胞可检测定形内胚层的形成。可继续将复孔细胞分化为中后肠球体（MH）。

注：在定形内胚层诱导过程中，细胞似乎会发生大量细胞死亡。尽可能缩短细胞在 37°C 培养箱外的时间。经过 24 小时的定形内胚层诱导后，细胞非常敏感，需要小心更换培养基。孵育 72 小时后，将形成紧密排列的内胚层细胞的汇合单层。

4、中/后肠 (MH)培养基的制备

（1）在第 3 天，准备第 3 - 8 天所需的 MH 培养基（基础培养基1 +补充剂 B +补充剂 C）体积（3 mL/孔）。

（2）以制备 3 mL MH 培养基为例：

在冰上解冻补充剂 B 和 C。在混入基础培养基1之前保持在冰上。充分混合。

注：如果不立即使用，请分装并在 -20°C 下储存。不要超过补充剂的保质期。解冻等分试剂后，立即使用，请勿重新冷冻。将 30 µL 补充剂 B和 30 µL 补充剂 C 加入 2.94 mL 冷的 (2 - 8°C)基础培养基1中。充分混合，储存在 2 - 8°C。

5、内胚层细胞分化为中/后肠 (MH)

（1）第 3 天：预复温(15 - 25°C) 足量的 MH 培养基 (0.5 mL/孔)。将剩余的 MH 培养基储存在 2 - 8°C。

（2）从内胚层细胞中吸去培养基，更换为 0.5 mL MH 培养基。在 37°C、5% CO2和 95% 湿度下孵育 24 小时。

（3）第 4 - 9 天：如下所述，每 24 小时进行一次完全培养基更换并评估球状体。

注：确保培养物在取出后 30 分钟内放回培养箱。

a. 在显微镜下观察单层。早在分化第 4 天就可能观察到 3D 结构。游离漂浮的中后肠球状体将在分化第 5 - 9 天出现。

b. 使用 1 mL 移液器，从细胞中吸去 0.5 mL 培养基，转移到无菌的 24 孔透明平底板中，以评估从细胞单层释放的中后肠球状体的数量和浓度。

c. 向细胞中加入 0.5 mL 新鲜的 MH 培养基。在 37°C、5% CO2和 95% 湿度下孵育。

注：虽然第 5 - 9 天释放的球状体都能产生小肠类器官，但细胞暴露于中后肠培养基的时间长短将控制发育中小肠类器官的区域特性，例如十二指肠（暴露时间较短）或回肠（暴露时间较长）。最高中后肠球状体产量的时间可能因不同 hPSC 细胞系而异。为获得可重复的实验结果，应始终使用在分化同一天生成的中后肠球状体来收获和启动人肠道类器官培养。通常在分化第 8 天观察到最多的出芽。

（4）球状体包埋当天：使用移液器，将每个孔中的球状体悬液加入新的 24 孔板的一个孔中进行计数。将大约 50 个游离漂浮球状体（基于之前的球状体计数）的相应体积加入 15 mL 锥形管中。进行肠道类器官的培养。

注意：中后肠球状体是直径 ≥ 75 µm 的细胞聚集体，有潜力产生一个人肠道类器官。多个融合的球状体应计为一个单元，该单元将生成一个人肠道类器官。剩余的单层培养物可用于检测中后肠的形成，或在后续几天进一步分化以包埋更多的球状体。

6、人肠道类器官生长培养基 (OGM) 的制备

（1）准备所需的肠道OGM培养基（基础培养基2+补充剂D）体积（2 mL/孔）。

（2）以制备 2 mL肠道 OGM 培养基为例：

在冰上解冻补充剂D。在混入基础培养基2之前保持在冰上。充分混合。

注：如果不立即使用，请分装并在 -20°C 下储存。不要超过补充剂的保质期。解冻等分试剂后，立即使用，请勿重新冷冻。

将 40 µL 肠道类器官补充剂D加入 1.96 mL 冷的 (2 - 8°C) 基础培养基2中。充分混合。使用前预热至室温 (15 - 25°C)。在 2 - 8°C 下储存长达 2 周。

7、将球状体包埋在 Matrigel中

（1）将低生长因子基质胶进行分装并冷冻保存（每等分试剂200μL 用于4个样本）。

（2）在冰上解冻一份低生长因子基质胶等分试样（每个样本需要 50 µL 低生长因子基质胶）。将一盒无菌的 100 µL 移液器吸头置于 -20°C。

（3）等收集到的MH球状体沉降到锥形管底部，小心吸出并弃去上清液。