产品描述
本产品为hPSC诱导分化全脑类器官试剂盒，人多能干细胞hPSC通过该试剂盒诱导分化可得到全脑类器官，该试剂盒通过四种组分完成经典的脑类器官分化流程即:神经外胚层分化、神经上皮出芽及神经管形成、神经扩张、脑成熟。诱导过程需要植入EB球于低生长因子基质胶，诱导38天以上的全脑类器官表达TUJ1、SOX2、Nestin、NeuN等基础神经表征、FOGX1、CTIP2等前脑、皮层表征,进入长期培养后≥80天可少量表达GFAP、TH等功能神经元及胶质细胞Maker。
本试剂盒需要操作人员具有hPSC培养经验，对类器官具有一定了解。
规格数量
该试剂盒规格可获得生成超过196个脑类器官，建议每次诱导以1/2个六孔板启动分化流程，形成至少98均一大小EB球进行全脑诱导流程。
实验仪器、材料
仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱
材料：离心管（规格为15 mL 和 50 mL）、移液器（规格为 10 μL、100 μL、1000 μL和多通道100μL）、无菌吸头（规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（规格为10mL、50mL）、10µL/100 μL宽口移液器吸头、6孔板（TC处理/非低吸附）、6孔超低吸附板、超低吸附96孔U底板
试剂盒内容
研究阶段 | 产品名称 | 产品规格 | 储存 |
拟胚体形成阶段 | 基础培养基1 | 200 mL | -20℃，6个月 |
补充剂A 500X | 400 uL | -20℃，6个月 | |
神经外胚层分化阶段 | 基础培养基2 | 100 mL | -20℃，24个月 |
神经出芽分化阶段 | 基础培养基3 | 200 mL | -20℃，24个月 |
神经成熟分化阶段 | 基础培养基4 | 200 mL | -20℃，24个月 |
神经成熟维持阶段 | 基础培养基5 | 200 mL | -20℃，24个月 |
其他相关试剂耗材
产品名称 | 来源 | 货号 |
hESC/iPSC细胞培养试剂盒 | IMMOCELL | IMC-014 |
干细胞基质胶 | IMMOCELL | IMV-A026 |
DMEM/F-12 | IMMOCELL | IMC-205 |
低生长因子基质胶 | IMMOCELL | IMV-A019 |
Dulbecco's磷酸盐缓冲液(DPBS)，不含钙、镁、酚红 | IMMOCELL | IMC-409 |
酒精 | - | - |
6孔板（TC处理/非低吸附） | - | - |
6孔超低吸附板 | - | - |
超低吸附96孔U底板 | - | - |
Accutase | - | - |
10µL/100 μL宽口移液器吸头 | - | - |
台盼蓝 | - | - |
试剂盒使用流程
hESC/iPSC细胞准备
在6孔板（TC处理/非低吸附）上使用hESC/iPSC细胞培养试剂盒将hESC/iPSC细胞培养至汇合度70-80%。
拟胚体(EBs)形成（第0-2天）
拟胚体形成培养基制备
拟胚体形成培养基（12 mL/3孔）: 使用前先恢复至室温，12 mL基础培养基1+1 x 24μL 补充剂A ，现配现用。在室温（15 - 25°C）下解冻补充剂，彻底混合。注意：如果不立即使用的话，最多在2 - 8°C储存2周，不要超过基础培养基和补充剂的保质期，解冻后立即使用，不要反复冻融。如果不混合补充剂，请将补充剂放入-20°C保存。不要超过补充剂的保质期。 解冻后立即使用。不要反复冻融。
①Day 0-2
1. 使用前将培养皿、培养基和试剂恢复至室温（15 - 25°C）。
2. 当iPSC/hESC生长至70-80%汇合度，镜下观察细胞状态良好。
3. 对于3孔/6孔板 80% 密度的iPSC/hESC细胞，准备拟胚体形成培养基（12 mL/3孔）。准备3mL Accutase、50 mL DPBS无菌不含钙镁，和10 mL DMEM/F12预热到室温。
4. 使用不含钙镁的室温DPBS洗涤六孔板的三个孔一遍，弃掉DPBS，s每孔加入1mL的Accutase 37度消化3min。
5. 当看到克隆发白发亮，轻轻拍打板侧（每侧拍两下），把细胞拍下来，再在生物安全柜中，加入1mL DMEM/F12终止消化，吹打至细胞完全脱落且成单细胞型态，进行台盼蓝计数细胞活力高于90%即可进行下一步诱导。
6. 160g/ 5min 离心收集到的6mL 细胞悬浮液，弃掉上清加入12mL的拟胚体形成培养基 ,再次检测细胞活力和细胞计数，最终每mL的细胞量在50000-80000 之间最佳。
7. 准备一个超低吸附的96孔U底板，将12mL的细胞悬液（含补充剂A）加入加样槽中，使用排枪/移液枪每孔加入100uL的细胞悬液。加样完成后将培养皿用封口膜封好使用水平板式离心机1200rpm/3min离心。
8. 撕掉封口膜放入细胞培养箱培养过夜、第二天每孔加入100uL 基础培养基1。
9. 48 小时后悬浮的细胞即可聚集成球，边缘光滑圆润的EBs状态最佳。后续进行下一个实验操作。
注：PSC克隆出现问题、自分化及漂浮的情况应再启动复苏扩增一株，不可直接用于诱导。
神经外胚层分化（第2 - 6天）
使用前将培养皿、培养基和试剂恢复至室温（15 - 25°C）。
①Day 2-6
1. 将诱导好的EBs转移到超低吸附6孔板里，每孔加入10个EBs后使用DPBS洗涤一次清除上个阶段的培养基残留，吸弃DPBS后每孔加入2ml的基础培养基2，每天2天换液一次，诱导共4天。
2. 出现神经外胚层扩张的EB边缘变的透亮，直径＞400um，内部致密无空腔，整体呈现类似小鼠原代神经球的型态。
神经出芽（第6 - 25天）
使用前将培养皿、培养基和试剂恢复至室温（15 - 25°C）。
①Day 6-25
1. 当EBs直径达到相关标准时400-600um即可进行基质胶包埋，4度化冻分装的低生长因子基质胶 2ml。
2．准备一张长宽均10cm的封口膜，在200ul枪头盒上按压出凹点，放置于10cm皿，使用酒精浸泡30 秒后置于安全柜紫外烘干30min以上即可使用。
3. 使用宽口10-100 μL移液枪头(量程50 μl)吸取神经外胚层分化结束的EB与按压的凹点上，一次建议操作10个为佳。之后使用移液枪小心的吸弃凹点内的培养基残留后，每个凹点及EBs加入30 uL的低生长因子基质胶小心包埋EBs，如若EBs在胶体边缘则使用10 μL小枪头轻轻挑弄EBs周围的胶体让其置于中央部位。(注意不要形成气泡)。
4. 将包埋好的EBs盖好，放于37度凝胶15min后使用无菌的镊子夹起封口膜，用1 mL的基础培养基3将每排的EBs胶体贴着凹点的底部吹到超低吸附6孔板中，每孔最多放置10个类器官，每孔培养基体积不能大于3mL。
5. 如若一次性制作太多EBs，也可以直接将预冷30min以上的12 mL的基础培养基3补充10%的低生长因子基质胶，（也就是1.2 mL的胶体）漩涡混匀后。吸弃原孔板中的基础培养基2，每孔补充3 mL基础培养基3+低生长因子基质胶，诱导48小时后吸弃培养基，使用DPBS洗涤两次，再次加入3 mL每孔不含基质胶的基础培养基3进行第6步操作。
6. 将超低六孔板放置于水平摇床(80rpm/s)里37度培养18天完成神经上皮的扩张，每两天换液一次。EBs 一般在神经上皮扩张第4天的时候出现早期VZ、SVZ样的结构、12天后芽点慢慢汇合变黑。
神经及脑成熟（第25天后）
使用前将培养皿、培养基和试剂恢复至室温（15 - 25°C）。
①Day 25+
1. 当EBs中心致密、外层形成疏松的上皮结构且直径大于1mm说明神经扩张到成熟阶段，完全弃去基础培养基3，每孔加入3 mL的基础培养基4持续培养至38天后(每两天换液一次/80rpm/s)，EBs的直径大于2mm时内部会出现营养无法渗入的情况，需要使用1mL注射器将EBs周围的胶体小心的去掉后每孔加入3mL基础培养基5(每天换液)，并提高摇床转速至120rpm/s改善营养循环状态，让脑类器官可以长期培养＞100天。
