产品描述
本产品为hPSC诱导分化皮质脑类器官试剂盒，人多能干细胞hPSC通过该试剂盒诱导分化可得到皮质脑类器官，该试剂盒通过前脑腹侧化信号通路调控技术，专为模拟人脑皮质发育及功能研究设计的标准化培养体系。该体系通过时序激活Wnt/β-catenin及梯度抑制BMP/Smad信号，驱动人源多能干细胞（PSC）定向分化为高纯度谷氨酸能神经元（VGLUT1/2 阳性率>85%），并同步诱导放射状胶质细胞（Pax6+/BLBP+）形成仿生脑室区结构。可在60天内稳定生成直径1.5-2.0 mm的层状皮质类器官，其特征性表达深层皮质标志物TBR1（第Ⅴ-Ⅵ层）及表层SATB2+神经元（第Ⅱ-Ⅳ层），并伴随MBP+/MOG+少突胶质细胞介导的致密髓鞘化（LFB染色阳性率>70%）。该体系通过三维旋转生物反应器或超低粘附孔板中（3DRBC，氧梯度维持在8-12%）实现高通量培养（单批次≥96个类器官）。本模型适用于神经退行性疾病（如阿尔茨海默症tau 蛋白病理建模）、精神分裂症NMDA受体功能解析及自闭症谱系障碍突触可塑性研究，同时兼容单细胞测序和钙成像动态追踪技术。
本试剂盒需要操作人员具有hPSC培养经验，对类器官具有一定了解。
规格数量
该试剂盒规格可获得生成超过200个脑类器官，建议每次诱导以1个六孔板启动分化流程，形成至少60-100个均一大小神经上皮球（理想形成率60%）。
实验仪器、材料
仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱
材料：离心管（规格为15 mL 和 50 mL）、移液器（规格为 10 μL、100 μL、1000 μL和多通道100μL）、无菌吸头（规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（规格为10mL、50mL）、1mL/200 μL宽口移液器吸头、6孔板（TC处理/非低吸附）、6孔超低吸附板、超低吸附96孔U底板
试剂盒内容
研究阶段 | 产品名称 | 产品规格 | 储存 |
神经上皮分化阶段 | 基础培养基1 | 200 mL | -20℃，24个月 |
基础培养基2 | 100 mL | -20℃，6个月 | |
补充剂A 500X | 400 uL | -20℃，6个月 | |
神经球形成阶段 | 基础培养基3 | 200 mL | -20℃，24个月 |
神经莲座扩张阶段 | 基础培养基4 | 400 mL | -20℃，24个月 |
皮质脑成熟阶段 | 基础培养基5 | 200 mL | -20℃，24个月 |
其他相关试剂耗材
产品名称 | 来源 | 货号 |
hESC/iPSC细胞培养试剂盒 | IMMOCELL | IMC-014 |
干细胞基质胶 | IMMOCELL | IMV-A026 |
DMEM/F-12 | IMMOCELL | IMC-205 |
Dulbecco's磷酸盐缓冲液(DPBS)，不含钙、镁、酚红 | IMMOCELL | IMC-409 |
hESC/iPSC 传代工作液（无酶） | IMMOCELL | IMC-014-E2 |
6孔板（TC处理/非低吸附） | - | - |
超低吸附96孔U底板 | - | - |
6孔超低吸附板 | - | - |
Accutase | - | - |
台盼蓝 | - | - |
200μL /1 mL宽口移液器吸头 | - | - |
试剂盒使用流程
hESC/iPSC细胞准备
在6孔板（TC处理/非低吸附）上使用hESC/iPSC细胞培养试剂盒将hESC/iPSC细胞培养至汇合度70-80%。
神经上皮分化（两种分化方式）
①神经上皮干细胞NESC的二维诱导
1. 使用前将培养皿、培养基和试剂恢复至室温（15 - 25°C）。
2. 当iPSC/hESC传代后两天直接进行神经上皮诱导，观测细胞形态成小岛状克隆，细胞克隆密度低于30%、无单细胞胁迫生长样及应激态球状克隆团即可进行诱导。弃去hESC/iPSC细胞培养试剂盒使用 DMEM/F12 润洗两次细胞去除漂浮细胞后每孔加入2 mL基础培养基1，每2天换液一次，直到细胞克隆密度达到80%, 10x显微镜下观测克隆边缘圆润光滑、细胞核缩小且变多，诱导时间计3-4天。
注：PSC克隆出现问题、自分化及漂浮的情况应再启动复苏扩增一株，不可直接用于诱导。
②．从 EB球直接神经上皮诱导（新手建议此方法进行分化)
1.使用前将培养皿、培养基和试剂恢复至室温（15 - 25°C）。
2. 将iPSC/hESC细胞培养至80% 的克隆密度、克隆边界清晰圆润、细胞核质比正常即可进行EB诱导，DPBS洗涤细胞两遍后使每孔用500μL的Accutase或者hESC/iPSC 传代工作液（无酶），消化6-10分钟，观测克隆变圆皱缩变亮、摇晃可见少量细胞脱离基质即可终止消化。
3. 吸弃消化液，如若使用Accutase消化导致细胞大量漂浮则不吸弃，使用等量的DMEM/F12终止消化。而hESC/iPSC 传代工作液（无酶）消化则吸弃后直接每孔加入500μL 基础培养基2重悬细胞后收集于15mL或50mL离心管中（根据消化液种类灵活选择）。
4. Accutase消化后的细胞120g离心5分钟弃除上清后，加入按消化的孔数*500μL 的体积加入基础培养基2重悬并补充1X补充剂A，而hESC/iPSC 传代工作液（无酶）消化后的细胞直接加入原重悬体系的（消化孔数*500μL）的体积的基础培养基2后补充1x补充剂A。
5. 将细胞悬浮液+ 1x补充剂A加入加样槽中或10cm细胞培养皿，使用排枪每孔100μL 加入超低吸附96孔u底培养皿中，封口膜包好后水平甩板机1500rpm离心5分钟，37度细胞培养箱培养过夜，第二天每孔加入100μL 基础培养基2 (不含补充剂A)，EB形成总时间约48小时。
6. 第三天完全吸弃培养基，每孔加入200μL 基础培养基1培养三天，第二天吸弃 100μL再补液100μL去除培养代谢废物。
神经球形成（直接从EB诱导神经上皮的方法不参考2-4，直接看5)
1. 使用前将培养皿、培养基和试剂恢复至室温（15 - 25°C）。
2. 将6mL Accutase预热至室温后，放入生物安全柜，每孔使用1mL的DPBS洗涤诱导的神经上皮干细胞两次，每孔加入800μL-1000μL的Accutase，放入培养箱消化5-8分钟，每4分钟观测一次细胞状态，细胞克隆边缘卷起、细胞间隙变亮且有少量细胞漂浮于消化液中即可终止消化。
3. 从侧壁处吸弃消化液，每孔加入1mL的基础培养基3重悬细胞后定容于12mL的基础培养基3+12 μL的1x补充剂A，如若细胞消化过度大部分完全飘起则使用每孔1mL的DMEM/F12
终止消化后120g/3min离心收集细胞后定容于12 mL的基础培养基3+12μL 1x补充剂A，注意:定容前台盼蓝染色检测细胞活性高于80%即可进行下一步操作。出现神经外胚层扩张的EB边缘变的透亮，直径＞400um，内部致密无空腔，整体呈现类似小鼠原代神经球的型态。
4. 离心结束细胞应聚集于孔的一侧，放入培养箱中培养24h后每孔再次加入100μL的基础培养基3不含补充剂A，神经球形成诱导时间计2天。
5. 对于直接形成 EB 后诱导神经上皮的体系，完成 3 天的诱导后完全吸弃基础培养基1每孔加入250μL 基础培养基3诱导2天。
神经莲座扩张(两种方案一致）
1. 使用前将培养皿、培养基和试剂恢复至室温（15 - 25°C）。
2. 当神经球直径达到相关标准时（200-600μm），使用宽口200μL 移液枪头吸出神经球于超低吸附6孔板中，每个孔最多容纳10个神经球，所以最少准备2个六块板启动神经莲座扩张。
3. 神经球进入6孔板中后，轻柔的每孔加入2mL基础培养基4后，放入十字/旋转摇床80rpm/s上培养18天，每1-2天换液一次/每孔换液2mL。
皮质脑成熟
1.使用前将培养皿、培养基和试剂恢复至室温（15 - 25°C）。
2. 当神经球中心和外侧出现黑色的斑点状结构说明神经莲座扩张到适合阶段，完全弃去培养基每孔加入2mL的基础培养基5放入十字/旋转摇床80rpm/s上培养18-26天/每2-3天换液一次即可用于鉴定和下游实验。成熟的脑类器官结构上IF染色可见TUJ1/SOX2标记的细胞形成VZ和SVZ样的结构，且高表达谷氨能相关基因，使用基础培养基5长期于摇床培养可以培养至120天中心细胞不出现凋亡。
3. 当皮质脑培养至直径大于1mm以上时，需对其进行切割减少内部细胞凋亡的情况。使用锋利无钝口的2号手术刀片将一个1mm以上的皮质脑类器官切割成2-4块，DPBS洗涤一遍类器官后，使用宽口1000μL移液枪头转移至15mL离心管中自然沉降（约需要5-8min），吸弃DPBS上清后，加入基础培养基4+1x补充剂A转移入超低粘附六孔板80rpm/s 培养4天，每天换液。4天后加入更换为基础培养基5 120rpm/s 继续维持培养，可延长培养时间和类器官活性至180天。
