产品描述
本产品为hPSC诱导分化体节类器官试剂盒，人多能干细胞hPSC通过该试剂盒诱导分化可得到体节类器官，该成熟类器官轴向延伸、细胞分裂、上皮化，重现人类体节形成和轴向发育的各个方面。
本试剂盒需要操作人员具有hPSC培养经验，对类器官具有一定了解。
实验仪器、材料
仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱
材料：细胞培养板（规格为：96孔）、离心管（规格为15 mL、50 mL）、移液器（规格为 10 μL、100 μL、1000 μL）、无菌吸头（规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（规格为10mL、50mL）
规格数量
使用96孔平底低附着板，可诱导5板体节类器官，体节类器官数量至少480个，诱导效率诱导效率在70-80%。
实验试剂
研究阶段 | 产品名称 | 产品规格 | 储存 |
Ⅰ阶段（D-1-0） | 基础培养基1 | 20mL | -20℃，12个月 |
补充剂A | 50μL | -20℃，6个月 | |
补充剂B | 50μL | -20℃，6个月 | |
Ⅱ阶段（D1-3） | 基础培养基2 | 200mL | -20℃，12个月 |
补充剂C | 200μL | -20℃，6个月 | |
补充剂D | 200μL | -20℃，6个月 | |
Ⅲ阶段（D4-9） | 基础培养基3 | 50mL | -20℃，12个月 |
补充剂E | 5mL | -20℃，6个月 | |
补充剂F | 250μL | -20℃，6个月 |
其他相关试剂
推荐试剂&材料
试剂&材料 | 品牌（e.g.） | 货号（e.g.） |
hESC/iPSC细胞培养试剂盒 | 逸漠生物 | IMC-014 |
hESC（H9） | 逸漠生物 | IM-H522 |
hESC/iPSC传代工作液 | 逸漠生物 | IMC-014-E |
Y-27632 | 逸漠生物 | IMC-014-Y |
DMEM/F12培养基 | 逸漠生物 | IMC-205 |
Matrigel | Corning | 354277 |
Accutase | STEMCELL | 07920 |
DPBS | 逸漠生物 | IMC-409 |
6孔细胞培养板 | 硕华生物 | N/A |
96孔细胞培养板 | 青岛金典生化器材有限公司 | N/A |
15 mL/50 mL离心管 | 硕华生物 | N/A |
10 μL/200 μL/1000 μL无菌吸头 | 佳顺生物 | N/A |
10mL/50mL移液管 | NEST | N/A |
实验内容与方法
1、Ⅰ阶段（D-1-0）（按1个六孔板，每孔2mL算）
（1）hPSC于基质胶包被的六孔板的一个孔生长至70-80%汇合度。
（2）吸去培养基。
（3）将5mL基础培养基1、补充剂A和补充剂B充分混合（可培养六孔板2孔），按每孔2mL的体积接种到六孔板中，然后将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育1天。
2、Ⅱ阶段（D1-3）（按1个96孔板，每孔100μL算）
（1）孵育24h后，吸去培养基。
（2）孔中加入1mL PBS（无钙镁离子）洗，吸去。
（3）孔中加入1mL Accutase，37℃消化3min。
（4）消化完成后于显微镜下可看到克隆发白发亮。轻拍孔板侧边几下，使细胞脱离板底，加入1mL 基础培养基1终止消化，并使用P-1000吸头将这2mL细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
（5）离心结束，去除上清至剩20ul，轻弹管底3-4下，将1 mL预热的基础培养基1（含10μM Y-27632）重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
（6）使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞 ，按每孔500个细胞的比例将所需细胞收集到离心管中，将10mL基础培养基2、补充剂C与补充剂D充分混合（可培养2个96孔板），将上面计数所得的细胞悬液加入5mL的含补充剂C/D的基础培养基2中，将细胞吹打均匀，然后按每孔50μL/500个细胞的体积将细胞悬液接种到96孔低吸附U形板中，1000rpm离心5min，然后将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h。
（7）24h后，每孔加入150μL基础培养基2，然后将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h后，再次把培养基换成150μL基础培养基2，接着再孵育24h。
3、Ⅲ阶段（D4-9）
（1）等聚集体开始长出小的轴突体后，取出补充剂E置于4℃解冻，将1mL补充剂E与50μL补充剂F加入10mL冷的基础培养基3中，反复吹打溶解20次。将培养基换成80μL/孔含补充剂E/F的基础培养基3，再将类器官和培养基转移到96孔平底低附着板中，将培养皿放入培养箱中，37℃，5%CO2 培养24-48h。
