产品描述
本产品为hPSC诱导结肠类器官成熟培养基，可以维持hPSC诱导分化结肠类器官试剂盒（IMV-C002）诱导分化获得的结肠类器官的长期生长、传代扩增。
该诱导分化成熟培养基不含补充剂G含量，仅用于后续结肠类器官的扩增使用，若初次诱导分化结肠类器官，请使用hPSC诱导分化结肠类器官试剂盒（IMV-C002），在初始分化结肠类器官阶段添加补充剂G，以免影响结肠类器官分化效率。
本产品需要操作人员具有hPSC细胞培养经验，对类器官具有一定了解。
实验仪器、材料
仪器：生物安全柜、细胞培养箱、水平式离心机、倒置显微镜、低温冰箱
材料：细胞培养板（规格为：6孔、12孔、24孔）、离心管（规格为15 mL 和 50 mL）、移液器（规格为 10 μL、100 μL、1000 μL）、无菌吸头（规格为 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（规格为10mL、50mL）
产品规格
产品名称 | 产品规格 | 储存 |
hPSC诱导结肠类器官成熟培养基 | 125mL | -20℃，3个月 |
500 mL |
其他相关试剂
产品名称 | 来源 | 货号 |
低生长因子基质胶 | IMMOCELL | IMV-A019 |
DMEM/F-12 | IMMOCELL | IMC-205 |
庆大霉素 | - | - |
PBS缓冲液 | IMMOCELL | IMC-401 |
类器官回收液 | IMMOCELL | IMV-A005 |
抗细胞粘附润洗液 | IMMOCELL | IMV-A003 |
TrypLE™ Express 酶 (1X)，酚红 | Gibico | 12605010 |
类器官冻存液 | IMMOCELL | IMV-A002 |
实验内容与方法
1、更换人结肠类器官成熟培养基（HCO）
（1）初次诱导分化结肠类器官后，3天进行一次HCO成熟培养基（不含补充剂G）的更换，并向每个培养孔中新增500μL HCO成熟培养基（不含补充剂G），在 37°C、5% CO₂ 和 95% 湿度下进行培养。
（2）每周进行3次培养基更换，并每隔10-14天将类器官培养物转移到新的含基质胶的培养基中，更换时应按照适当传代比例（每个培养皿约80-100个器官细胞数）进行操作。
注：在第一次传代后，可将抗生素（如 50μg/ml 庆大霉素）加入到培养基中
（3）经过第3次传代后，结直肠组织细胞团应已完全形成，即可进行鉴定和相关实验。
注：经过多次传代后，细胞生长速度可能会下降，这可能是由于间充质细胞及干细胞数量减少的原因。
2、人结肠类器官传代
（1）吸除培养基，加入预冷的PBS溶解基质胶，将混合液转移到离心管中，300g离心 3min，去除上层的 PBS和基质胶。注：所有与类器官接触的耗材都需要用抗粘附液润洗1-2次，例如枪头与离心管等。
（2）加入 1mL Tryple，吹打5-8次，使类器官与Tryple 充分接触，接着转移到培养箱中，静置消化2-3分钟，具体时间需根据类器官大小和密度优化。 再加入4ml HCO成熟培养基（不含补充剂G）终止消化，吹打使类器官变成小细胞团，300g 离心3min，去除上清;注：不要完全消化成单细胞或者太小的细胞团。
（3）用预冷枪头按每孔30-40μL 的量在离心管中加入适量的基质胶，在冰上快速、轻柔地混合均匀，注意吹打过程中避免产生气泡;
（4）将提前放在培养箱中的24孔板取出,将细胞-基质胶混合液快速滴加至预热的培养板孔中央，滴加混合液时，逐渐向上移动枪头，使细胞均匀分布在胶中;
（5）将培养板放在培养箱中，正置孵育20-30min，使胶滴凝固；
（6）胶滴凝固后，沿孔壁缓慢加入预热好的HCO成熟培养基（不含补充剂G）。将培养板放回培养箱，定期（如每2-3天）更换培养基，并在显微镜下观察类器官的生长和形态。
3、人结肠类器官冻存
（1）吸除培养基，加入预冷的PBS溶解基质胶，将混合液转移到离心管中，300g离心 3min，去除上层的 PBS和基质胶，如果无法去除，建议使用类器官回收液去胶。注：所有与类器官接触的耗材都需要用抗粘附液润洗1-2次，例如枪头与离心管等。
（2）加入 1mL Tryple，吹打5-8次，使类器官与Tryple 充分接触，接着转移到培养箱中，静置消化2-3分钟，具体时间需根据类器官大小和密度优化。 再加入4ml HCO成熟培养基（不含补充剂G）终止消化，吹打使类器官变成小细胞团，300g 离心3min，去除上清;
注：不要完全消化成单细胞或者太小的细胞团。
（3）加入冻存液，混匀，程序降温后置于液氮保存。
