产品描述
本产品为神经母细胞瘤细胞向神经元诱导分化试剂盒，分化获得的神经元能表达特异性标志物（如 MAP2、βIII-tubulin 等），适用于体外研究。
本产品需要操作人员具有SH-SY5Y细胞培养经验，对该细胞具有一定了解。
以六孔板为例，本产品提供的规格可供2.7个6孔板的SH-SY5Y分化。
本产品分化流程图
产品信息
表1. 试剂盒组成信息
注：括号内容如25×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A（25×）和补充剂B (200×)需添加进基础培养基1使其分别稀释25倍以及200倍，使得补充剂终浓度为1×，配成分化培养基1。
实验试剂与材料
表2. 推荐试剂&材料
实验内容与方法（以6孔板1个孔为例）
一、试剂准备
表3. 各阶段培养基成分
(1) 在 4℃解冻 补充剂 A、B、C，不要在 37℃条件下解冻。
(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如分化培养基1组成为基础培养基1、1×浓度的补充剂A和1×浓度的补充剂B，若用量为40mL，配制方法为 38.2 mL基础培养基1+ 1.6 mL补充剂A（25×）+ 200μL补充剂B（200×）。
(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。
注：补充剂B或含有补充剂B的分化培养基1使用时尽量避强光，且所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。
二、SH-SY5Y培养和准备（详见SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞（STR鉴定正确）使用说明）（http://www.immocell.com/ryxbx/1529.html#section1）
三、DAY 0-6:第一阶段
(1) 低生长因子基质胶（GFR Matrigel ）在4℃下解冻，与DMEM/F12均匀混合（GFR Matrigel :DMEM/F12=1:100），铺板，备用。
(2) DAY 0: 当SH-SY5Y的汇合度达到80%以上时，吸去培养基，用2mL 1×室温PBS（不含Ca2+/Mg2+)进行清洗，吸去PBS。
(3) 加入0.25%胰蛋白酶消化液(含EDTA，含酚红)，置于37℃培养箱中消化1-3 min（视细胞情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，加等量培养基（SH-SY5Y细胞专用培养基或DMEM高糖培养基）终止消化。
(4) 使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到15mL离心管中，室温下300 g离心5 min。
(5) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的SH-SY5Y细胞专用培养基重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(6) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，使用SH-SY5Y细胞专用培养基稀释细胞使得最终细胞浓度为0.5-1.5 × 105个细胞/mL（或最终细胞密度为1-3.125×104个细胞/cm2）。
(7) 包被板恢复至室温后，从GFR Matrigel包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏GFR Matrigel涂层表面。将细胞接种到GFR Matrigel包被的板上，在6孔板中每孔最终体积为2 mL，将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24h。
(8) DAY 1: 24h后吸去培养基，并加入2mL 分化培养基1（成分为：基础培养基1，1×补充剂A，1×补充剂B）。
(9) 隔天使用分化培养基1换液，直到第6天。
注：①GFR Matrigel使用时需在冰上操作，所有与GFR Matrigel直接接触的物品需提前预冷，GFR Matrigel超过10℃将迅速凝固，导致包被失败。②GFR Matrigel包被的板需在室温孵育1小时或培养箱孵育30分钟以上，使其恢复至室温，才能进行细胞接种。
四、DAY 6-11:第二阶段
(1) DAY 6： 第6天，从培养物中抽吸培养基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室温PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除PBS。
(2) 每孔加入2 mL 分化培养基2（成分为：基础培养基2，1×补充剂C）。
(3) 隔天使用分化培养基1换液，直到第11天。
(4) 可取第11天的细胞进行免疫荧光染色检测神经元标志物MAP2、βIII-tubulin
免疫荧光鉴定
