产品描述
本产品为人多能干细胞向心肌细胞诱导分化试剂盒，分化获得的心肌细胞具有搏动能力，能表达特异性标志物（如 Cardiac Troponin T 等），适用于体外研究。
本产品需要操作人员具有细胞培养经验，对心肌细胞具有一定了解。
以六孔板为例，本产品提供的规格可供6个孔的hPSC诱导分化，对于静态悬浮诱导，最终可获得至少3×106 个心肌细胞，对于贴壁诱导最终可获得至少7.5×106 个心肌细胞。
本产品分化流程图
对于悬浮诱导：
对于贴壁诱导：
hPSC：人多能干细胞；CM：心肌细胞
产品信息
表1. 试剂盒组成信息
产品货号 | 产品名称 | 产品规格 | 储存 |
IMI-M001BM | 基础培养基 | 300 mL | 2℃-8℃，12个月 |
IMI-M001A | 补充剂A(50×) | 5.4 mL | -20℃，12个月 |
IMI-M001B | 补充剂B(1000×) | 500 µL | -20℃，6个月 |
IMI-M001C | 补充剂C(50×) | 720 µL | -20℃，6个月 |
IMI-M001D | 补充剂D(25×) | 5.8 mL | -20℃，6个月 |
心肌纯化补充剂(50×) | 600 µL | -20℃，6个月 | |
IMI-M001X | 心肌细胞消化液 | 10 mL | -20℃，6个月 |
注：括号内容如50×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A（50×）和补充剂B (1000×)需添加进基础培养基使其分别稀释50倍以及143倍，使得补充剂A终浓度为1×，补充剂B终浓度为7×，配成心肌诱导培养基1。
实验试剂与材料
表2. 推荐试剂&材料
试剂&材料 | 品牌（e.g.） | 货号（e.g.） |
hESC/iPSC细胞培养试剂盒 | 逸漠生物 | IMC-014 |
hESC（H1） | 逸漠生物 | IM-H522 |
hESC/iPSC传代工作液 | 逸漠生物 | IMC-014-E |
Y-27632 | 逸漠生物 | IMC-014-Y |
RPMI-1640基础培养基 | 逸漠生物 | IMC-202 |
Matrigel（生长因子减量） | Corning | 356231 |
Laminin 521 | 恺佧 | LMN-HM522 |
Accutase | STEMCELL | 07920 |
心肌细胞冻存液 | 逸漠生物 | IMC-705 |
PBS | 逸漠生物 | IMC-401 |
低吸附6孔细胞培养板 | CORNING | 3471 |
15 mL/50 mL离心管 | 硕华生物 | N/A |
10 μL/200 μL/1000 μL无菌吸头 | 佳顺生物 | N/A |
10mL/50mL移液管 | NEST | N/A |
实验内容与方法（以hESC H1及6孔板1个孔为例）
一、试剂准备
表3. 各阶段培养基成分
研究阶段 | 培养基名称 | 各阶段培养基组成 |
中胚层诱导阶段 | 心肌诱导培养基1 | 基础培养基 |
补充剂A（1×） | ||
补充剂B（7×） | ||
心肌诱导培养基2（悬浮诱导） | 基础培养基 | |
补充剂A（1×） | ||
心肌中胚层诱导阶段 | 心肌诱导培养基3 | 基础培养基 |
补充剂A（1×） | ||
补充剂C（1×） | ||
心肌诱导培养基2 | 基础培养基 | |
补充剂A（1×） | ||
心肌细胞诱导阶段 | 心肌成熟培养基 | 基础培养基 |
补充剂D（1×） |
(1) 在 4℃解冻补充剂 A、B、C、D，不要在 37℃条件下解冻。
(2) 在生物安全柜中，参考表1及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如心肌诱导培养基1组成为基础培养基、1×浓度的补充剂A和7×浓度的补充剂B，若用量为12 mL，配制方法为11.676 mL基础培养基+240μL补充剂A（50×）+84μL补充剂B（1000×）。
(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。
注：所有补充剂以及心肌细胞消化液可根据使用量进行分装以避免反复冻融。
二、hESC培养和准备（详见 hESC/iPSC细胞培养试剂盒使用说明书）
（http://www.immocell.com/xiazai/hESC(H1)%E5%9F%B9%E5%85%BB%E8%AF%B4%E6%98%8E%E4%B9%A6.pdf操作说明书）
（http://www.immocell.com/xbpyvideo/4240.html操作视频教程）
三、DAY 0-2: hESC向中胚层诱导
对于悬浮诱导：
(1) DAY -1: 当hESC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1×室温PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。
(2) 加入1mL含Y-27632（10 μM）的室温Accutase，转移到37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。
(3) 3-5min后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入Accutase中，并使用P-1000吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将单细胞悬液收集到15mL离心管中，室温下200 g离心5 min。
(4) 离心结束，充分去除上清，将1 mL预热的hESC/iPSC 完全培养基（含10μM Y-27632）重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(5) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，按2.5 × 105-1× 106个细胞/mL，接种于低吸附6孔板中每孔最终体积为2 mL（含10μM Y-27632），将孔板转移到37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24 h。
(6) DAY 0: 24 h后，100g离心3min，吸去培养基，加入2mL心肌诱导培养基1（成分为：基础培养基，1×补充剂A，7×补充剂B）重悬，转移至原孔内。
(7) DAY 1：使用心肌诱导培养基2（成分为：基础培养基，1×补充剂A），按步骤（6）操作换液，继续培养24 h。
注：①对于一般细胞株，其细胞球初始直径尽量控制在50μm-100μm附近，若过大，可转移至摇床（60 rpm）上分化，避免细胞球之间融合粘连。换液时尽量不要过多吹打细胞球，除低速离心外，还可将细胞球吸至15mL离心管，待其自然沉降，弃上清换液。除了用低吸附板外，还可使用经过防止细胞贴壁的特殊液体润洗的板进行培养。
②若想提高产量，可以增加细胞接种量全程在转速60rpm摇床上分化，但是要求形成的细胞球初始直径控制在100μm-300μm左右（一般初始接种量为1× 106个细胞/mL）。
③由于不同细胞株呈现的生长特性不同，因此不同细胞株所需的最初接种密度可能不同，需自行探究，对于绝大多数细胞株，静态培养接种量为2.5× 105个细胞/mL，生长一天可达到50μm-100μm左右。对于部分敏感细胞，接种密度可增加至1× 106个细胞/mL。
④特别注意要防止细胞球之间粘连。
⑤补充剂B 7×的浓度适用于绝大多数细胞分化，若分化失败，可在5×-15×范围内探究最佳浓度（推荐在12孔板或24孔板上进行浓度梯度探究）。
对于贴壁诱导：
(1) hESC按照《hESC/iPSC细胞培养试剂盒使用说明书》步骤传代至laminin521或生长因子减量基质胶包被的六孔板上。
(2) DAY 0：当hESC的汇合度达到95%以上时培养基换为2mL心肌诱导培养基1（成分为：基础培养基，1×补充剂A，7×补充剂B），
(3) 培养48h，中途观察培养基颜色若变黄则及时使用心肌诱导培养基1换液。
注：补充剂B 7×的浓度适用于绝大多数细胞分化，若分化失败，可在5×-15×范围内探究最佳浓度（推荐在12孔板或24孔板上进行浓度梯度探究）。
四、DAY 2-7: 中胚层向心肌中胚层诱导
对于悬浮诱导：
(1) DAY 2： 将细胞球摇晃至中心，缓慢倾斜一定角度，沿着液面缓慢弃去培养基，在不吸到细胞球的情况下尽量将培养基吸尽。每孔加入2 mL 心肌诱导培养基3（成分为：基础培养基，1×补充剂A，1×补充剂C），于培养箱培养48 h。
(2) DAY 4：将细胞球摇晃至中心，缓慢倾斜一定角度，沿着液面缓慢弃去培养基，在不吸到细胞球的情况下尽量将培养基吸尽。每孔加入2 mL 心肌诱导培养基2（成分为：基础培养基，1×补充剂A），隔天换液，直到DAY 7 。
注：除步骤中换液方式外，还可将细胞球吸至15mL离心管，待其自然沉降，弃上清换液，换液时尽量不要吹打细胞球。
对于贴壁诱导：
换液培养基及换液时间节点步骤同悬浮诱导。注意，若培养基变黄请及时换液。
五、DAY 7-15: 心肌中胚层向心肌细胞诱导
对于悬浮诱导：
(1) DAY 7: 将细胞球摇晃至中心，缓慢倾斜一定角度，沿着液面缓慢弃去培养基，在不吸到细胞球的情况下尽量将培养基吸尽。每孔加入2 mL 心肌成熟培养基（成分为：基础培养基，1×补充剂D），隔天换液，直到DAY 15 。
(2) DAY 15: 将细胞球摇晃至中心，缓慢倾斜一定角度，沿着液面缓慢弃去培养基，在不吸到细胞球的情况下尽量将培养基吸尽。每孔加入2 mL 心肌细胞消化液，于培养箱中孵育3-4 h。待单个细胞颗粒明显时，随后使用同等体积的心肌成熟培养基（含10μM Y-27632）中止消化，吹散。
(3) 200 g离心弃去上清，可加入心肌成熟培养基重悬接种于Matrigel上进行维持培养，或加入冻存液进行冻存。
注：1、在第8天至第15天之间，可观察到搏动的细胞球。
2、消化时可将六孔的细胞球收集至2孔或3孔进行消化。冻存液可以使用90%FBS+10%DMSO或心肌细胞冻存液（逸漠生物，IMC-705）进行冻存。
3、若进行2D维持培养，消化时可使用心肌细胞消化液消化1-2 h。
4、进行2D培养时，若杂细胞较多，可加入心肌纯化培养基进行纯化。观察纯化情况，可纯化2-4天，期间换一次液。
5、注意，不同细胞株的分化效率会有差异。
对于贴壁诱导：
换液培养基及换液时间节点步骤同悬浮诱导。注意，若培养基变黄请及时换液。
注：若接种在laminin521上分化，则消化时可使用含有10μM Y-27632的胰蛋白酶消化3-5min。由于细胞贴在laminin521上比较牢固，若使用心肌细胞消化液可能需要延长消化时间1-2h。
