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常见问题

细胞聚团的原因及如何避免细胞聚团

时间：2021-09-09 10:08:04 点击：10127次

不知道小伙伴在细胞培养过程中，有没有遇到细胞消化过后，仍有些细胞分散不开，吹又不敢吹，弃又弃不净，结果聚团细胞像滚雪球一样越聚越大、越聚越多情况，细胞聚团原因是什么，是污染还是操作失误，遇到细胞抱团如何处理呢?

我们知道当在生长培养基中进行单悬浮细胞培养时，样本中出现细胞丢失的情况并不少见。当细胞破裂时，它们会释放DNA和碎片，导致细胞聚集成大团块，使其难以扩张。细胞聚团既可导致细胞凋亡，也可引起细胞死亡。随着更多的细胞死亡并释放碎片，问题将继续恶化，所以尽可能快地处理或避免细胞聚团将有利于实验的后续结果。

细胞聚团的原因

首先要明确一点，常规的“抱团”是指贴壁细胞被消化后悬浮状态下的聚集情况。细胞在贴壁生长时，聚集在一起是正常现象。当周围细胞寥寥无几，而这一团已经叠层生长，这就是在悬浮状态就已经聚团的细胞再贴壁导致的。相同条件下，培养的癌细胞对密度依赖性的生长抑制敏感性降低，所以即使在形成单层后，也不会停止生长，而是相互堆积形成多层生长的聚集体。

防止细胞聚团的最佳方法之一是了解是什么导致了细胞聚集，并采取预防措施避免这些事件的发生。培养物中细胞可能聚集的一些原因包括：

1.过度消化-某些用于组织分解的酶，如胰蛋白酶，如果过量使用会导致细胞结块。很多人觉得细胞多多益善，经常将贴壁细胞养到叠层、或密集程度特别高时才进行传代，如果一直这样，不仅会缩短传代时间，导致操作密集;同时细胞的老化会更加严重。另外，细胞死亡时释放DNA，会“抓住”其他细胞，形成黏性的细胞团，若不及时处理，整体细胞状态会恶性循环。

2.环境压力-物理压力和反复的温度变化会导致细胞死亡，从而导致细胞的“粘性”的DNA分子将相邻的细胞连接在一起

3.组织分解-在制备单细胞悬浮液时，使用酶、机械或化学分解策略可使细胞破裂，从而导致碎片的聚团。

4.过度生长-当细胞在其培养基中密度过大的时候，细胞将开始溶解并释放碎片，碎片中的粘性因子会将细胞聚集到一起

5.污染-某些细菌和真菌病原体导致细胞溶解;结块通常是细胞培养物被污染的迹象。部分细胞被污染后会出现细胞聚团，这和操作有很大关系，比如：传代铺板时，是否进行了活细胞计数并及时调整浓度;终止消化时间点是否准确;混匀是否过于轻柔或粗暴;胰酶是否浓度过高;离心收集时，加速度是否过大等，都会直接影响子代细胞状态。

6.虽然其中一些是由于实验错误而发生的，但实际也有部分的细胞具有天生的聚团现象，比如大部分的半悬浮细胞，BV-2 ,NCI-H716等等，半悬浮细胞一般在在整体汇合度70%左右就要进行传代操作了，这样可以降低细胞聚成大团块的风险。

为什么细胞聚团是个问题?

单细胞悬浮培养基的目标是为靶细胞提供尽可能多的生长资源。这包括充足的生长营养和充足的繁殖空间。当细胞聚集在一起时，它们会相互限制，降低细胞对营养吞吐量，最终影响生长结果。

细胞聚团也会导致靶细胞的回收率降低，并且会干扰标记，这也是悬浮细胞标记的成功率不高的原因，某些细胞分析方法，如流式细胞术，需要对细胞进行适当的分离。在流式细胞术中，大量细胞以快速的液流通过机器。这台被称为细胞仪的机器检测不同细胞之间物理特性的差异，并使用荧光灯对它们进行相应的标记。如果细胞通过试管时聚集在一起，细胞仪将很难准确测量它们的特性。这会导致它们被不正确地分类，并对实验结果产生负面影响。

聚团细胞状态都不好吗

若细胞轮廓清晰，胞体通透，呈串状均匀聚集，证明其状态较好，正在分裂。但是大多数情况下，聚团细胞都是轮廓模糊，细胞透光性差，甚至出现合胞体，同时伴有细胞碎片，这证明细胞已经衰老或者产生病变，状态不佳。

如何避免聚团细胞的生成

首先确认当前细胞生长密度及状态，80%左右的生长密度即可进行传代，此时细胞状态较好，且用于传代的数量也足够。

传代操作前，使用缓冲液对细胞进行适当且全面地润洗，清除死亡的细胞团和部分堆叠杂质(在选择适当胰酶浓度时，对于不同代数的不同细胞系需进行一定的调整，如：部分贴壁牢固的细胞应将胰酶分装后，进行预热处理;细胞密度过高时，应该向胰酶中加入少量缓冲液，缓慢均匀地消化细胞等。对于贴壁格外牢固的细胞，可以尝试多次分批进行消化，最大限度保证细胞状态)。

在消化过程中，需均匀慢速晃动培养器皿，以免局部胰酶浓度过高而影响传代。切勿用力摇动，导致边缘松动的大片细胞直接脱落，从而增加细胞成团几率。

培养器皿的选择也需注意，部分实验室会使用玻璃培养瓶，因细胞贴壁在玻璃底更容易分离。同时玻璃材质的亲水性和塑料有区别，而且玻璃细胞培养瓶都是实验室内部处理，可能会有清洁残留，在一定程度上抑制细胞的贴壁生长，并且更容易消化，细胞之间的连接比贴壁还要紧密，聚团几率很大。

另外，避免传代过程中汇合度较大，本身1:3甚至1:4都可以正常培养的细胞被1:2传代，会导致母代细胞浓度过高，在分化过程中出现堆叠现象，所以在每次细胞传代前要对细胞进行计数。

适当的处理和设备使用，也可以减少结块。如果使用离心机分离或混合样品，将其设置为正确的速度可以减少聚团，通常情况下，较快的速度可以离心散细胞，但在高速下也必须考虑细胞的脆弱性，所以适当的延长离心的时间也不失为一种稳靠的离心散悬浮聚团细胞的方法。

还有一些方法可以分离细胞，这些细胞聚集在一起，不会造成过度的伤害。某些叫做螯合剂的化学物质与正电荷离子有亲和力。根据细胞聚团的性质，可以添加螯合剂来溶解它们之间的粘连，而不会伤害细胞。乙二胺四乙酸(EDTA)是一种螯合剂，常用于溶解钙粘连。

另一种细胞清除方法是氚化。氚化过程涉及到温和、重复的吸管，以打破细胞间的弱粘。

已经聚团的细胞，只能弃掉吗

如果预实验比较紧急，或者细胞株较为珍贵，也可以在复苏新细胞的同时，进行聚团细胞“拯救”。

可以将带有聚团细胞的样品低密度连续传代，约三代过后，逐渐分散为独立个体，再通过监测细胞活力状态，判断是否可用来进行下游实验。若肉眼可见，即可直接通过清洗和吸出，或是在消化后将悬起的细胞样品静置数十秒以沉淀团块。对于死细胞聚团，可以在细胞液中适量加入DNase以断裂DNA。