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细胞培养传代常见问题汇总

时间:2021-12-29 16:22:46 点击:3128次

许多科研小伙伴在第一次接触到细胞培养传代时,可能会遇到一些问题,导致手忙脚乱,为此,小逸特定收集整理汇总一些新手们在细胞培养传代常见问题及相应解决方案,希望能帮助到大家。

1、一般拿到细胞后,应该注意什么

收到细胞先不开盖,用酒精将整个细胞瓶外壁进行消毒,放在培养箱静置若干小时后(看细胞密度而定)在倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对细胞进行不同倍数拍照(建议收细胞时的培养基拍一张照片,观察培养基的颜色和是否有漏液情况,显微镜下拍细胞100X,200X各两张),排除细胞本身污染的情况。

大鼠主动脉内皮细胞图片

2、何时须更换培养基

视细胞生长密度而定,常规细胞2-3天更换培养基。

3、细胞何时进行传代较好

一般情况下细胞生长至完全汇合后就应该传代,所有细胞生长都有一个要求不宜生长过密(也就是常说的长老了),但有接触抑制的细胞,在汇合前就必须进行传代,这类细胞一般在密度70-80%就进行传代,否则会引起细胞分化。

4、贴壁细胞如何进行传代

去掉原T25培养瓶里面的培养基,T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;弃PBS,再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞,显微镜下观察,待细胞变圆,细胞间隙明显,部分细胞刚开始脱离瓶壁,加4 ml左右完全培养液混匀终止消化,将细胞小心吹打下来,1000 rpm/min室温离心5min;弃上清,细胞沉淀用完全培养液重悬,按要求分瓶(视细胞密度而定1:2-1:3,1:3-1:6,1:6-1:8),每T25瓶补足培养基至5-6 ml,37℃、5%CO2孵箱培养。

5、悬浮性细胞应如何传代处理

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,将细胞悬液移入离心管中,1000 rpm/min 室温离心5 min。弃上清,细胞沉淀用完全培养液重悬,按要求分瓶(视细胞密度而定1:4-1:8),每T25瓶加完全培养液至4-5 ml,37℃、5%CO2孵箱培养。有些悬浮细胞趋于成团生长,此时细胞生长状态良好,当补液时,需避免反复吹打。

大鼠皮肤成纤维细胞图片

6、贴壁细胞传代如何使用胰酶

一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时,易造成培养基中细胞碎片增多,黑渣子增多,常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化,对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化,细胞密度过高超过80%时,采用分步消化法。胰酶储存在–20°C,解冻在4°C进行,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20°C,避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低,并可减少污染之机会。

7、如何控制胰酶消化时间

胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤:消化过度细胞碎片增多,黑渣子增多,细胞会成片脱落,严重影响细胞活性,并有部分细胞漂浮,随弃去的胰酶流失;消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下,反复吹打同样也会损伤细胞活性。

不同细胞对消化液的敏感性不同,胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度,是否含EDTA,胰酶的储存时间,胰酶的储存温度,是否反复冻融,消化加入的胰酶体积,消化温度及细胞的密度有关。消化对于新购买的细胞,建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间,可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆,记录最佳消化时间,下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

8、细胞离心下来的离心速率应为多少

细胞传代或冻存时欲回收细胞,其离心速度一般为800-1000 rpm/min,室温离心5-8分钟,转速过高,将造成细胞破裂死亡。

9、如何区分活细胞和死细胞

显微镜下观察:活细胞中间透亮,饱满,有光泽,死细胞较暗。也可以通过台盼蓝染色来计算细胞活力。

10、如何用台盼兰计数活细胞

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200~2000 个/毫升,在0.1 毫升的细胞悬液中加入0.1 毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞,注意计数需在加入台盼蓝10min内完成。有细胞计数仪的,可直接用计数仪进行。

11、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。

12、使用胰蛋白酶加入EDTA是为什么

EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。

13、可否使用与原先不同的培养基

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基,若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基,细胞大都无法立即适应,易造成细胞状态不好,最终造成细胞无法存活。

14、可否使用与原先不同的血清种类

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。

15、细胞为何生长不均匀

细胞传代后放入培养箱没有摇匀,或者放入时摇匀,但在细胞贴壁前,又移动了培养瓶,频繁开关培养箱引起的振动或者培养瓶中培养液过少,培养箱搁板表面不平整,这些因素会导致细胞生长不均匀。

16、购买的细胞死亡或细胞存活率不佳

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。运输过程对细胞有严重影响。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80°C太久。

17、细胞抱团怎么处理

一些悬浮细胞抱团生长是正常现象,大部分悬浮细胞在细胞密度很高的情况下,很可能会出现部分细胞抱团生长的现象,聚团细胞很容易死亡并演化成絮状物,殃及周围的悬浮细胞,因此在培养悬浮细胞时需控制好细胞密度。如果出现了细胞团,可以通过细胞筛去掉部分较大的细胞团,也可以尝试一下方法:将细胞悬液收集到15 ml离心管中,静置20 min左右,小心取上层细胞上清培养(该方法只能去除部分较大的细胞团)。

18、细胞内有空泡,是否是正常现象

部分细胞本身存在一定的空泡(如HepG2,Ishikawa及一些耐药株等),这个是正常现象。如果只有少数细胞有内出现极少空泡,则很可能是细胞状态不佳,可以通过调整血清浓度,控制消化,控制传代比例及时间等方法来调整细胞状态;如果大部分细胞出现空泡,且单个细胞内空泡数目偏多,则可能细胞代次较高,细胞老化所致,需更换代次较早的细胞。

19、细胞传两代后开始逐渐死亡的原因

很可能是培养体系不适合细胞(未使用推荐的培养体系);或者消化过度,对细胞有严重影响;或者是传代比例不合适(具有密度依赖性的细胞,传代太稀;或者生长较快的细胞,传代较密,细胞严重堆叠生长)。

20、细胞生长速度缓慢是什么原因

细胞生长过慢有很多原因,其主要原因如下:

1)细胞的传代次数太多,所以获得一个新的、亚培养次数较少的细胞储存液很有必要。

2)未选择合适的细胞收获时机。

在使用新的细胞储存液的同时,也要把我好适宜的细胞收获时机,一般在对数生长期的后期是细胞收获时间当细胞达到100%融合后,由于生长过于拥挤,会逐渐进入缓慢生长阶段,此时,细胞的活跃度也会随之下降。

培养基、血清、缓冲液等质量差,或者配方不合理。培养基、血清等培养物质是细胞生长的主要营养来源,所以其质量直接会影响到细胞的生长状态。所以高质量的培养基及合理的试剂配方维持细胞的良好生长具有决定的作用。

3)CO2浓度与缓冲系统需求不匹配,导致pH控制不足。

一般来说,细胞培养液中缓冲液中NaHCO3的浓度与CO2浓度成正比例关系。缓冲液中NaHCO3 的浓度高,所需求的CO2浓度也较高;这样才能达到PH平衡。

4)微生物污染,尤其是支原体

及时检查污染,防止微生物污染,做好支原体、器皿、环境消毒、支原体清除等工作。

5)培养物光敏降解产生细胞毒性物质。

如果培养基长时间暴露于荧光将会导致光敏感培养基组分转化成细胞毒性自由基和H2O2,从而影响到细胞生长甚至细胞凋亡。所以平时要在暗处保存细胞核培养基,避免荧光暴露。

6)不精确的细胞计数方法将导致细胞生长不良

a.确保计数样本充分混合,避免局部细胞密度差异影响精确计数

b.再次检查使用血球计数板进行细胞计数的所有运算

细胞增殖变慢有以下原因:1. 消化过度 2. 传代过密 3.细胞营养不良 4.细胞频繁传代 5.细胞状态不佳或老化 6.细胞存在污染。

21、细胞解冻后缺少活力,活细胞占比较低

这种现象可能主要由以下几种原因所导致

1)培养物冻存液等质量欠缺

解决方案

a.确保用来制备储存物(冻存液)的起始培养物需要保证其健康、无微生物污染、处于生长对数期后期状态。

b.收获细胞时需要小心翼翼,避免细胞损伤。

2)储存物冻存方法不当

解决方案

a.在液氮冷冻细胞时,确保细胞、培养基和其他试剂的浓度,以及冻存实验步骤依照供应商的建议。一般来说,冻存应该缓慢,大约1-3° C/min以减少冰晶形成。

b.使用电子可编程或机械冷冻装置以确保一致的、适当速率的冷冻。

c.选择最合适的细胞冷冻保护剂。如果使用甘油,不要将其存储在光照下,因为曝光会使甘油转化为有对细胞毒性的丙烯醛。

3)储存物保存不当

解决方案

a.储存物应时刻保持在-130℃,理想情况是置于液氮中,以确保较大的细胞活性。

b.如果将细胞直接浸入液氮中,容易造成液氮泄露到冻存管内,解冻时会有冻存管爆炸的风险。所以一般储存在液氮上方的气相环境中。

4)细胞解冻方法不当

解决方案

a.一般来说,细胞应该快速解冻、使用预热的培养基、尽快移除含有冷冻保护剂的培养基防止细胞活力下降。

b.确保小心操作细胞。不要涡旋或高速离心,因为低温保存后的特别容易受到损伤。

22、细胞进行解冻或传代后细胞的附着力偏低

这种情况主要是因为湿度过低致使培养容器上集聚静电所致

可以通过适当增加房间湿度,使用防静电装置或者用消毒过的湿毛巾擦拭培养容器外侧,来减低静电产生。另外试剂混合不均匀,培养瓶转速等因素也可导致此现象发生。所以在进行细胞培养时,要确保细胞和所有试剂的溶液混合充分。在使用振荡培养箱进行细胞培养时,注意设置适宜的转速。

23、为什么细胞生长会不均匀

1)细胞或培养基的混合不充分:在培养基中接入细胞后应当轻摇混匀,在进入振荡培养箱后,保证持续稳定的振幅频率,避免局部浓度差异。

2)在细胞培养过程中有时候会出现同一时期相同器皿之间细胞生长不平衡。

这种情况可能是由于培养箱内部的温度不均一所导致。注意做好以下两点:

a.避免将培养器皿叠放,因为底部的培养器皿最靠近金属架可能加热最快。

b.如果放在培养箱前部的培养器皿比后面的生长慢,要注意保持培养箱的门尽可能关严,并将前面的培养器皿移到后面。

24、培养细胞时应使用5%或10%CO2

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统,而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g时,细胞培养时应使用10% CO2;当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时,则应使用5% CO2培养细胞。

25、CO2培养箱之水盘如何保持清洁

定期(每周一次)更换水盘里面的水,水盘的水必须使用无菌蒸馏水或无菌去离子,水盘中可添加1%硫酸铜以预防霉菌污染。

26、细胞接种密度多少合适

依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的一个重要原因。按照我们的经验:一般倍增时间24 h内的细胞,传代比率1:6-1:12为宜,倍增时间24-48 h的细胞,传代比率1:3-1:8为宜,倍增时间超过48h的细胞, 传代比率1:2-1:4为宜。

27、培养用dish,flask是否相同

不同厂牌的dish或flask,其所coating的polymer不同,制造程序亦不同,虽对大部分细胞没有太大之影响,惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。

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