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细胞培养基中常见添加剂介绍

时间:2022-11-21 11:53:30 点击:718次

细胞培养过程中,细胞培养基是不可或缺的,细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质,也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养一般是液体培养基,成分主要是水、葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清;而植物培养基用合成培养基就可以了,一般是固体培养基,成分主要是矿质元素、蔗糖、纤维素、植物激素、有机添加剂;其次是各自培养的原理上的不同,微生物细胞培养的原理是微生物细胞的增殖,动物细胞培养的原理是细胞的增殖,植物细胞培养原理是细胞的全能性。


通常细胞体外培养时需要加入血清,以维持细胞的生长和存活。而除了血清之外,部分细胞在培养过程中需要添加胰岛素和β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)等成分来维持细胞状态。MCF-7和NIH:OVCAR-3等细胞需要额外添加胰岛素,而Thp-1和MC3T3-E1 subclone 14等细胞则需要添加β-巯基乙醇,不同细胞加入量会有差异,需根据细胞类型判断。

同一种培养基也会因其添加物的不同而应用于不同的细胞培养和不同的实验需求,下面就详细介绍下细胞培养基中各种添加剂的功能。

1. L-谷氨酰胺(L-Glutamine)在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?

L-谷氨酰胺(L-Glutamine)是细胞生长的必须氨基酸,可作为培养细胞的能量来源,参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中状态不稳定,它的降解速率随保存时间,保存温度及保存环境pH值等变化而变化。L-丙胺酰-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine)是细胞培养中广泛使用的L-谷氨酰胺的替代品,其在水溶液中稳定性高,即可保持长时间稳定的营养供给,也降低了分解产物造成的细胞毒性。L-丙胺酰-谷氨酰胺溶液(L-alanyl-L-glutamine slution)可作为哺乳动物贴壁细胞或悬浮细胞培养添加剂。与谷氨酰胺相比,L-丙胺酰-谷氨酰胺不会自行降解成氨而导致细胞毒性,作为添加物培养条件更加可控,可有效提高细胞活力。

1.1液体培养基中谷氨酰胺的作用及使用方法

几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求,细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。所以,各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置-20 ◦C 冰冻保存,用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基 4 ◦C 冰箱储存两周以上时,应重新加入原来量的谷氨酰胺。

2. GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用 GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?

GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽,是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的 alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。

3. 培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

细胞通常以葡萄糖作为碳源,丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。如果没有足够的葡萄糖供应,细胞就会选择丙酮酸钠作为代谢底物。丙酮酸是糖酵解途径中一个中间产物,也是 EM(Embden Myerhoff)途径的第一步,所以培养基中添加的丙酮酸既可以作为能量的来源也可以为细胞的代谢提供碳骨架。对于某些特殊的细胞,丙酮酸对维持细胞的生存是必需的,丙酮酸对于某些细胞的繁殖和低血清浓度的增殖也是必不可少。培养基中的丙酮酸钠浓度一般是 0.1 mM,商品化的丙酮酸钠一般是 10mM (100X)的溶液。

丙酮酸钠(Sodium Pyruvate)是最常见的丙酮酸盐,是一类内源性小分子物质,丙酮酸钠和丙酮酸均是天然存在于人体内,并参与全身各组织和器官的代谢。丙酮酸钠在医学上、诊断试剂以及医疗器械中被广泛用作缓冲剂、赋形剂和抗氧化剂。在人体中行动中大多数细胞只利用葡萄糖作为能量的物质就够了,而在细胞培养中丙酮酸钠是必须的物质。丙酮酸钠在培养基中起到替代碳源的作用,参与细胞营养代谢。Hep G2,Caov-3及 NCI-H1395细胞培养基中就需要额外添加丙酮酸钠,以维持细胞良好的生长状态。

4. Hank′s 平衡盐溶液(HBS)和 Earle′s 平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

HBS 和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在 Eagle′s(2.2g/L) 中比在 Hanks′(0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的 CO2 平衡,以维持溶液的 PH 值。Eagle′s 液在空气水平的CO2中,溶液会变碱,Hanks′液在 CO2 培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagle′s液,如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks′液就可以了。

5. 培养液pH对细胞生长的影响?

由于大多数细胞适宜pH为7.2-7.4,偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同,原代培养细胞一般对pH变动耐受差,无限细胞系耐受力强。但总体来说,细胞耐酸性比耐碱性强一些。在配制培养用液时,需要注意一点:新配的培养基在经过 0.10um 或 0.22um 滤膜过滤时,溶液的pH 还会向上浮动0.2左右。 

6. 培养细胞时应使用5%还是10%CO2,或者根本没有影响?

一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为pH的缓冲系统,而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中 NaHCO3含量为每公升3.7g时,细胞培养时应使用10% CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5g时,则应使用5%CO2培养细胞。

7. 在培养基中加入 HEPES 有何好处?

培养基中最常用的缓冲体系是碳酸氢盐,它可提供营养,但却在生理 pH 条件下会降低缓冲能力。而HEPES 是一种很强的缓冲剂,能使细胞培养基在 pH7.2-7.6 条件下缓冲能力增强。

HEPES溶液:是一种弱酸,中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸,主要作用是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下,观察细胞时培养基脱离了 5%CO2 的环境,CO2 气体迅速逸出,pH迅速升高,若加了HEPES,此时可以维持 pH7.0 左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。神经细胞原代培养的过程中能用到。

8. NaHCO3的作用

培养基中使用了 NaHCO3-CO2 缓冲系统,并采用开放培养,使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养瓶,再通过稳定调节温箱中CO2浓度(5%) ,与培养基中的NaHCO3处于平衡状态,从而调节培养基的PH值。

9. NEAA:非必须氨基酸

NEAA(非必需氨基酸) 是含几种非必需氨基酸的合剂,添加到的原培养基不同,NEAA 也有不同的种类,比如添加至MEM的NEAA,含L-Alanine、L-Asparagine、L-Aspartic Acid、 L-Glutamic Acid、L-Glycine、L-Proline、L-Serine。

10. 氯化钙

氯化钙对成骨细胞培养有毒性,所以成骨细胞的培养基中应不含氯化钙。

11. 什么培养基中可以省去加酚红?

酚红在培养基中用作pH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。酚红本身对生物制品质量并不会产生影响,可以通过纯化技术去除,但酚红在无血清培养基可能带来胞内钠/钾失衡,影响细胞生长,当然这种作用能被血清所中和或减轻。酚红并不是培养基中必需的一种成分,很多国外的疫苗或抗体生产企业在生产过程中都使用无酚红培养基。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。

12.bFGF 和 EGF

bFGF是一个肝素结合的多肤类丝裂源,广泛分布于各种组织中。bFGF 是一种重要的细胞增殖分化调节剂,可刺激多种细胞的增殖。有研究发现它对滋养细胞也有促增殖作用。bFGF 主要是与细胞膜上FGF受体结合发挥作用,刺激与增殖有关的基因表达。Thomson 等认为,像其他体外培养的人体细胞一样,hES 细胞要求 bFGF 的存在以促进增殖。同理EGF(上皮生长因子) , 是人体内的一种活性物质,由53个氨基组成的活细胞,藉由刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化,达到修补增生肌肤表层细胞,据说对受伤、受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效,其最大特点是能够促进细胞的增殖分化。所以加入他们都是促进细胞增殖的。

13.胰岛素(干细胞)

胰岛素(Insulin)作用广泛,包括调节脂肪和蛋白质的代谢以及促进细胞生长等。胰岛素功能的发挥源于其对细胞的作用,进而引起组织乃至机体的整体反应。一般可将胰岛素在细胞水平的作用分为三大类:代谢作用、促生长作用、以及代谢和促生长混合作用。胰岛素对细胞的代谢调节作用主要是通过其与细胞膜上的胰岛素受体(Insulin receptor, IR)相互作用而介导,而胰岛素对细胞的促生长作用则是通过其与细胞膜上胰岛素样生长因子受体(IGF Receptor, IG)相互作用而介导的。在无血清细胞培养液中,常添加胰岛素来维持细胞生长,调节细胞对葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的摄取、利用和贮存,同时抑制糖原、蛋白质和脂肪的分解。

14. 无维生素 A 型 B-27 ® 添加剂

是定制的 B-27®添加剂,不含维生素A。维生素A(视黄醇) (能被转化成视黄酸,后者可以诱导干细胞向神经细胞的分化。不含维生素A的配方是干细胞培养的理想选择。添加剂是50x的液体,可以与 Neurobasal®培养基或 Neurobasal®-A 培养基组合使用,用于神经细胞培养而不需要再添加饲养层细胞。

15.双抗和三抗

保持细胞生长良好状态的法宝当属抗生素,适量浓度的的抗生素可有效防止微生物的污染。青霉素-链霉素混合溶液(100× 双抗)(Penicillin-Streptomycin Solution, 100×)是专门用于细胞培养的双抗,抗菌谱:革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液(100× 三抗)(Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution, 100×)也是可用于细胞培,抗菌谱:细菌、真菌和酵母。细胞培养需要了解不同细胞生长特性,还需要及时补充各类营养物质以保持细胞良好的状态。

培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质,也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。细胞培养基作为细胞生长的物质基础,被广泛应用于细胞生物学科和医学研究等生物技术产业的各个领域。


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