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细胞培养基本知识普及

时间:2022-11-30 11:59:27 点击:933次

很多科研小伙伴第一次接触细胞时,心情既紧张又兴奋,想雀雀欲试又害怕出错,所以,小逸整理一份细胞培养基本知识,希望可以帮助每一个科研实验者少走弯路。

首先,我们来了解什么是细胞培养?

细胞培养(cell culture)是指在体外模拟体内环境(无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等),使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术,在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术,还是其中之一的生物克隆技术来说,细胞培养都是一个必不可少的过程,细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞,这是克隆技术必不可少的环节, 而且细胞培养本身就是细胞的克隆。细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术,通过细胞培养既可以获得大量细胞,又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。

通过细胞培养我们可以获得大量的、性状相同的细胞,以便于研究细胞的形态结构、化学组成及功能和机制。

培养细胞之前,你需要做好这些工作

1.细胞培养前的准备

无菌操作

提前开启紫外照射30min消毒灭菌,工作台开灯通风10min,用75%酒精擦拭台面,并开启超净工作台风扇运转数分钟后,才开始实验操作。

每次操作只处理一株细胞株,避免细胞间交叉污染。

实验完毕后,将实验物品带出工作台,再次以 75% 酒精擦拭无菌操作台面。实验操作应在中央无菌区域,一般不要再边缘区域操作。

器材耗材备足

在开始细胞培养之前,先检查一下移液管和瓶子的数量是否充足,以免在开始实验后再次出入操作台,这样可以降低细胞污染的风险。

细胞培养基也应先预热,选择只预热部分培养基而非整瓶加热,不但可以节约实验时间,而且可以避免因反复加热培养基而造成的蛋白质降解。

结束操作后,需尽可能避光保存。

2.细胞培养的定期检查

定期检查培养细胞的形态,即形状和外观,对于细胞培养实验取得成功至关重要。

a.检查培养液颜色与透明度的变化,颜色变黄,说明PH值下降;变红或紫红色,说明PH值上升,细胞生长停滞、死亡,一般生长稳定的细胞2-3天换液一次,生长缓慢的细胞可3-4天换液一次。

b.观察细胞生长状态,细胞长满瓶底的80-90%,应及时传代。

c.观察细胞形态变化,细胞透明度大、折光性强、轮廓清晰为佳。

除确认细胞的健康状态外,每次操作细胞时通过肉眼和显微镜检查细胞还可早期发现污染征象,避免污染扩散至实验室其他细胞。

注意微生物污染,常常出现培养液混浊,液体内漂菌丝或细胞菌,不仅仅指微生物,包括所有混入培养环境中的细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物及细胞。

3.细胞变质的征象

细胞变质的征象包括核周出现颗粒、细胞与基质解离以及细胞质空泡形成。

这些变质征象可能为多种原因所致,例如:培养物污染、细胞系衰老或培养基中存在毒性物质,或者这些征象仅表明培养物需要更换培养基。

变质严重时将会成为不可逆的变化。

4.细胞培养通风橱的消毒及布局

a.保持细胞培养通风橱内的整洁有序,将所有物品置于直视范围内。

b.向放入通风橱内的所有物品喷洒70%乙醇,擦拭清洁进行消毒。

c.在通风橱中部开阔处放置细胞培养容器;移液器置于右前方易于取用;试剂和培养基置于右后方便于吸取;试管架置于中后部;小型容器置于左后部用于盛放废液。

5.培养瓶/皿等物品的无菌操作

无菌培养瓶、试剂瓶、培养皿等物品使用时方可揭开盖子,不得将其开放暴露于环境中,操作完成后尽快盖上盖子,取下盖子时应将盖子开口朝下放在工作台面上。

进行无菌操作时不要说话、唱歌或吹口哨。尽快完成实验,以尽量避免污染。

6.细胞培养中可能的污染物

细胞培养污染物主要分为两类

a.化学污染物,如培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂和去污剂。

b.生物污染物,如细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉污染。

可通过充分了解污染源以及采用良好的无菌技术,降低污染发生的频率和严重程度。

细胞培养污染筛查

细胞被污染了途径有以下几个

a.空气是微生物传播的最主要途径,操作时尽量避免说话、咳嗽、打喷嚏;

b.使用的培养器械及器皿清洗消毒不彻底;

c.培养两种以上细胞时,操作不规范,可能导致细胞交叉污染;

d.血清有问题,可能血清在生产时就已经被支原体或病毒污染;

e.原代培养的污染多数来源于组织样本。

7.交叉污染的确认

交叉污染虽不如微生物污染普遍,但与HELA细胞及其他生长迅速的细胞系间广泛的交叉污染是个明确的问题,会造成严重后果。

从声誉好的细胞库获取细胞系、定期检查细胞系性质及采用良好的无菌技术有助于避免交叉污染。

通过DNA指纹图谱、核型分析和同位素分析可确认有无交叉污染。

8.细胞换液注意事项

为细胞换液时,要沿着培养瓶的一侧轻轻地加入,而不是直接加到细胞中,以免损伤细胞,当培养的细胞株较为脆弱时尤其需要注意。

使用无菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液体时,每支吸管只能使用一次,以免交叉污染。

9.细胞传代的时间把握

当细胞呈指数增殖,贴壁培养的细胞已占据所有可用基质、没有扩增空间,或悬浮培养的细胞已超过培养基质所支撑的能力,无法进一步生长时,细胞增殖速度将大大降低甚至完全停止。

为了将细胞密度维持在最佳水平,以便细胞继续生长,并且刺激进一步增殖,必须对细胞进行传代。

10.细胞培养中使用抗生素的注意事项

细胞培养时不应长期使用抗生素,因为连续使用抗生素会促进抗生素耐药性细胞株的产生,导致轻度污染持续存在。抗生素只能作为对付污染的最后手段短期使用,并尽快撤除。

如果长期使用抗生素,则应同时进行无抗生素培养,以便作为鉴别隐性感染的对照。

11.细胞冻存的必要性

连续培养的细胞系容易发生遗传漂变,有限细胞系最终会发生衰老,所有培养的细胞都易受到微生物污染,即使运转情况最好的实验室也会遇到设备故障的问题。

由于已建立的细胞系是一种宝贵资源,更换细胞系成本高昂,而且耗费时间,因此,必须将其冷冻起来,长期保存。

12.细胞冻存的事项

应在细胞浓度高的情况下进行细胞培养冻存,并且细胞传代的次数尽可能少。

在冻存前确保活细胞的百分比至少为90%。

请注意,最佳冻存条件取决于所用细胞系。

冻存和复苏过程对大多数细胞都会造成不利影响,因此不要通过涡旋震荡或者用。

细胞培养无小事,每一步都需要操作者小心谨慎对待。为了养好细胞,我们需要对细胞的各种习性了如指掌,选择品质好的血清,有利于事半功倍。

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