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细胞培养中培养液颜色变化

时间:2023-03-16 15:40:14 点击:5861次

培养基的颜色主要来自酚红,酚红指示颜色非常灵敏,pH值范围为6-8,颜色由黄变为紫红。为了培养方便,能让我们直观地感觉培养液的状况,加入酚红后,如果培养液偏酸,就显示偏黄色,偏碱性则会显示偏紫色。一般来说,污染细菌或者长时间不换液时,培养基变成黄色,主要是因为细菌和细胞过度增长,产生了酸性物质。开封后的培养基保存在4℃冰箱中,培养基内的二氧化碳会逐渐溢出,pH偏碱性,所以培养基就偏紫色了。

偏紫色的培养基,可以通入无菌过滤的二氧化碳,调整pH值后继续使用。长时间没用完的碱性培养基不建议继续使用,会造成细胞生长停滞或死亡。

实验室的细胞培养中,培养基的PH值对实验的效果有很大的影响。因为培养基的PH值可通过影响培养物的营养元素的吸收、呼吸代谢、多胺代谢和DNA合成、植物激素进出细胞等作用直接或间接地影响愈伤组织形成及其形态建成。当PH值大于65 时,高温高压灭菌时会发生颜色反应。当PH值68时,颜色有质的变化。一般情况下灭菌的时间和压力对培养基颜色没有影响。

细胞培养中应注意的问题

1.细胞培养液中一定要加HEPES,作用是稳定液体的PH。

2.以培养基颜色的变化作为换液的指标,是不够,但很实用。因为培养液中有指示剂酚红存在,故液体颜色的变化可间接提示细胞生长的状态。细胞生长旺盛,产酸,液体呈黄色;反之,液体会呈紫红色。

3.在观察细胞时,液体ph变化大,会对细胞产生伤害,对细胞生长不利。

PS: HEPES的化学全称位呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。

传统细胞基础培养基是红色的,因为其中含有酚红,弱碱性的酚红呈红色,作为细胞培养pH指示。同时,由于缓冲体系的原因,要维持弱碱性的pH值需要使用二氧化碳培养箱。

是否所有的细胞培养基均适用同样的CO2浓度?其实不然,CO2浓度的选择取决于NaHCO3浓度。CO2和溶液中的-HCO3形成缓冲体系,使得整个培养体系的pH值维持在弱碱性(7左右),这也是哺乳动物细胞生长的最适pH值。当培养基长时间暴露在空气中是,-HCO3会迅速分解,pH值快速升高,视觉观感上即是从红变紫。当再次将培养基放到细胞培养箱中后,在CO2的作用下,又会缓慢地从紫变回红色。

不同的细胞培养基的NaHCO3浓度不一样,使用不用的细胞培养基应选择与之对应的CO2浓度:

NaHCO3 (g/L) 浓度<1.5时,所需CO2浓度为4%;

NaHCO3 (g/L) 浓度处于1.5-2.2时,所需CO2浓度为5%;

NaHCO3 (g/L) 浓度处于2.2-3.4时,所需CO2浓度为7%;

NaHCO3 (g/L) >3.5时,所需CO2浓度为10%。

随着细胞不断生长,pH值逐渐不断下降(由于乳酸的代谢性积累),培养基会变成黄色。当我们发现培养过程中培养液的pH发生不正常地变化时,我们需要这样做:

1.确定是否使用不当的二氧化碳浓度:依据培养基中的碳酸氢钠浓度来增加或降低培养箱中的二氧化碳百分比。对于2.0至3.7 g/L的碳酸氢钠,分别使用5-10%的二氧化碳浓度。或换用不依赖二氧化碳的培养基。

2.确定是否组织培养瓶盖子过紧:将盖子拧松1/4圈。

3.确定是否碳酸氢盐缓冲不充分:加入HEPES缓冲液,使最终浓度达到10-25 mM。

4.确定是否培养基中含有错误的盐分:请在CO2条件下使用Earle's盐培养基,在大气环境下使用Hanks'盐培养基。

5.确定是否细菌,酵母或真菌污染:丢弃培养物及培养基,尝试对培养物进行去污染。

DMEM细胞培养基颜色变化常见问题

1.为什么这个DMEM培养基是鲜红色的

培养基的颜色主要是酚红来显示的,酚红指示颜色非常灵敏,p值范围为6-8,颜色由黄变为紫红。酚红不是必须的,在有些情况下甚至是多余的,酚红有类似固醇类激素的作用,如果涉及到固醇类激素相关的细胞培养,最好不要添加。但是为了培养方便,能让我们直观地感觉培养液的状况,加入酚红后,如果培养液偏酸了,就显示偏黄色,偏碱性了就显示偏紫色。

2.为什么培养皿放在一个没有开启CO2的孵箱里面,培养液颜色偏紫色

一般的DMEM使用的缓冲体系是NaHCO3, 初中的时候应该见过如下的方程2NaHCO3=Na2CO3+CO2+H2O在没有CO2的孵箱中,培养液中的CO2一直溢出,碳酸变少了,溶液变碱性了,就偏紫色了。同时我们打开了很久的DMEM瓶里面的培养液也会慢慢偏紫色,也就是这个道理。

3.培养基偏紫色了还能用不

可以将该偏紫色的培养基置于CO2孵箱中,拧松瓶盖。一段时间之后你会发现颜色变为鲜红色了,那么可以继续接着用。但是不要使用过长时间未用完并且变色的培养液,置于空气下氧化之后培养基成分可能已发生了变化。

在细胞培养过程中,检查培养液颜色与透明度的变化,颜色变黄,说明PH值下降;变红或紫红色,说明PH值上升,细胞生长停滞、死亡,一般生长稳定的细胞2-3天换液一次,生长缓慢的细胞可3-4天换液一次。

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