技术支持

热销产品

HELA人宫颈癌细胞（STR鉴定正确）

货号：IM-H010 ¥1200元

HSF人皮肤成纤维细胞（免疫荧光鉴定）

货号：IM-H032 ¥1800元

Bel-7405人肝癌细胞（STR鉴定正确）

货号：IM-H035 ¥1200元

Hep G2人肝癌细胞（STR鉴定正确）

货号：IM-H038 ¥1200元

A549人非小细胞肺癌细胞（STR鉴定正确）

货号：IM-H113 ¥1200元

H9C2大鼠心肌细胞（种属鉴定正确）

货号：IM-R025 ¥1200元

4T1小鼠乳腺癌细胞（种属鉴定正确）

货号：IM-M017 ¥1200元

您的位置：首页>>技术支持>>逸漠细胞学堂

逸漠细胞学堂

第二课：Rho 激酶抑制剂能够有效永生化人的角质生成细胞

时间：2021-11-19 17:05:13 点击：672次

研究背景

人类生命的衰老归根结底是细胞的衰老。细胞的衰老限制细胞的生命周期，使细胞生长逐渐放缓乃至最后停止分裂。作为体细胞的角质生成细胞，其在皮肤生物学和皮肤相关病理学的研究和应用中具有至关重要的作用。但是，其有限的生命周期限制其在体外进行培养。

人的原代细胞需要同时克服两个阶段才能达到永生化阶段，分别为M1 (mortality stage 1，replicative senescence)和M2 (mortality stage 2，crisis)。在M1阶段，缩短的端粒能够激活p53和pRB信号从而抑制细胞周期的进行;M2阶段代表基因组极其不稳定的阶段，极短的端粒会导致染色体融合和移位。

Rho GTPase 作为RAS超家族成员在细胞粘连、迁移以及细胞骨架的信号通路中起调控作用。 Rho 激酶 (ROCK)是Rho 下游信号分子。通过抑制ROCK可以调控细胞并对疾病有治疗意义。在这篇文章里，Alison A. McBride团队发现，使用ROCK抑制剂，Y-27632，能够使角质生成细胞克服M1和M2阶段。

结果与方法

一、 Y-27632 永生化原代人的角质生成细胞

前期的研究结果表明，ROCK抑制剂能够影响角质生成细胞的增殖和分化。为了探索ROCK抑制剂在角质生成细胞的长期培养中的作用，作者在包头皮(HFK)、阴道(HVK)、宫颈外皮(HCK)三种组织的角质生成细胞培养液中加入10 μM Y-27632，并观察三类细胞的生长曲线(如图1)。在没有ROCK抑制剂Y-27632的存在下，这三类细胞在培养20-40代时到达平台期，无法继续增殖。当加入Y-27632之后，细胞在有限的培养代数下，未见平台期的形成。

三类细胞的生长曲线图

二、 Y-27632的永生化细胞能够再现原代角质形成细胞

作者对比早期代数和晚期代数培养的角质形成细胞以及Y-27632处理的角质生成细胞的形态学特征(如图2)，发现Y-27632处理的角质生成细胞和早期代数的角质生成细胞更接近。形态上，是边界明显的、微小的长方体形状。

Y-27632处理的角质生成细胞的形态学特征图

三、 Y-27632能够稳定端粒的长度

端粒逆转录酶(TERT)能够维持端粒长度的重要分子，其表达在体细胞中常常被抑制。因此，随着细胞分裂，细胞的端粒会逐渐缩短。当细胞端粒少于一定长度，细胞的复制性衰老被触发。大部分癌细胞通过重新激活端粒酶逆转录酶从打破M1阶段限制。作者通过定量PCR发现，Y-27632能够维持端粒酶的表达水平从而维持端粒的长度相对稳定(如图3)，其中使用HPV18永生化的角质形成细胞为对照。虽然Y-27632之后，细胞的端粒长度相对比较短，但是能够在50-120仍维持相对稳定，其长度与HPV18永生化的细胞相当。

Y-27632能够维持端粒酶的表达水平从而维持端粒的长度相对稳定图

四、 p16INK4, p53, p21CIP1和 MYC蛋白在Y-27632处理后的表达情况

角质生长细胞的永生化，需要同时跨越M1和M2阶段。因此单单端粒酶活性的增加并不足以使细胞永生化。为此，作者检测了p16INK4的情况，发现三种角质生成细胞在Y-27632处理后仍然有表达，但是这些表达的p16INK4是否有功能，作者没有进一步去研究。MYC蛋白能够结合到TERT的启动子的E-Box上从而诱导TERT的表达。通过检测，作者发现MYC在Y-27632处理组的表达虽然低于HPV病毒永生化的细胞，但明显高于未经Y-27632处理的对照组(图4)。P53作为DNA损伤应激诱导分子，其表达能够诱导细胞周期的停滞。作者使用放线菌素D诱导DNA损伤(图4B)观察P53以及下游的p21CIP1的表达情况。作者发现与HPV18永生化的细胞不同，Y-27632处理的细胞存在正常的p53信号通路。

五、角质形成细胞在Y-27632长期培养后经类器官培养仍能正常分化

McMullan的研究表明抑制ROCK信号通路能够抑制角质形成细胞的分化。通过类器官培养，在培养基中添加Y-27632并分析皮肤细胞产生的内啡肽。作者发现随着培养的进行，内咖肽的含量逐渐降低，这一结果佐证McMullan的研究：抑制ROCK信号通路能够抑制角质形成细胞的分化。但是将长期培养的角质形成细胞进行类器官培养，且不添加Y-27632，发现细胞能够分化成多层的表皮结构(图5)。

细胞能够分化成多层的表皮结构图

六、进过Y-27632长时间培养的HFKs能够表达合适的分化标志分子

为了进一步验证，图五中分化的多层表皮结构具有其特有的表面分子标志物。作者分别通过免疫荧光染基底层的标志物keratin 14，有棘层的标志物involucrin，颗粒层的标志物filaggrin。通过与原代的组织中角质形成细胞进行比较，发现进过18代Y-27632培养的角质形成细胞能够分化成原代组织相似的结构(图6)。

进过18代Y-27632培养的角质形成细胞能够分化成原代组织相似的结构图

总结与讨论

通过本文，作者得出角质生成细胞的永生化同时需要：基底细胞和Rho激酶的抑制剂。实验结果中有个相互驳斥的点：在Y-27632存在的情况下，角质生成细胞获得无限增殖的能力，但是p16INK4A仍然表达。作者猜测Y-27632的存在使细胞是在增殖和抗增殖的平衡中倾向于增殖。而p16INK4A的量太低而不能抑制细胞增殖。

另外，Y-27632处理的角质生成细胞即获得无限增殖的能力，又有完整的p53信号通路。移植体外培养的细胞，最大的担忧在于这类细胞具有潜在的成癌性。大部分成癌的细胞源于其p53信号通路的突变或者失活。从这个角度出发，Y-27632永生化的的角质生成细胞则少了这份担忧。

第二课：Rho 激酶抑制剂能够有效永生化人的角质生成细胞

研究背景

结果与方法

总结与讨论

大家都在看

相关问答