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逸漠细胞学堂

第七课：Y-27632依赖的转录组变化能够促进气管祖细胞克隆的形成

时间：2021-12-18 09:31:42 点击：724次

研究背景

呼吸道表皮是呼吸系统和外界环境接触的直接界面，呼吸道表皮细胞的异常会导致肺部疾病，例如哮喘，慢性阻碍性肺病等。关于呼吸道疾病的研究常原代肺的表皮细胞进行培养，但是其最大的弊端是获得细胞数少。然而，近期报道的条件性重编程技术则很好的解决了这个问题。

因此，本篇文章使用条件性重编程技术培养鼻咽拭子中的表皮细胞。而且，作者还测试了NIH3T3细胞作为基底细胞的效果。此外，作者发现通过Rock抑制剂的加入能够改变细胞的表达谱系从而促进细胞增殖。

实验结果

一、条件性重编程的方法能够有效保留鼻道基底组细胞

作者通过鼻咽拭子收集到的表皮细胞随机的进行普遍的培养(使用支气管表皮细胞培养基BEGM)和条件性重编程培养(CRC)(图1)。首先，作者从形态学分析了BEGM和CRC培养下，细胞形态的变化(图1A)。其次，作者分析BEGM和CRC培养下细胞角质类型的变化，发现两种培养条件下，细胞角质类型并没有明显差异(图1B)。再者，作者利用流式细胞仪分析呼吸道基底细胞的表面分子CD49f和CD151，发现CRC培养下同时表达CD151和CD49f分子的细胞比例明显增加(图1C-D)。接着，作者检比较两种培养条件下的细胞周期，发现其并没有明显改变(图1E)。最后，作者通过在两个代之间交换培养条件检测这两种培养条件对细胞克隆形成的影响，发现BEGM培养条件显著抑制细胞克隆的形成。

二、条件性重编程培养相较于BEGM培养更有利于鼻道基底组细胞扩增

为了比较BEGM和CRC对细胞增殖的影响，作者将CRC培养的细胞随后在BEGM和CRC培养技术进行传代，每次取4x105细胞进行传代(图2)。其中图2A表示的是不同代数中获得的鼻道基底组细胞的数目，图2B表示的是不同代数中鼻道基底细胞的扩增系数，图2C表示根据推算得到的不同代数获得总的基底细胞数。通过比较不同代数中形成的鼻道基底细胞的数目，作者发现两种培养方式整体的增殖都有所下降，但是CRC传代的获得的鼻道基底组细胞比BEGM多 (图2A，B)。但是通过CRC进行扩增能够获得比BEGM多398倍的鼻道基底祖细胞。

条件性重编程培养相较于BEGM培养更有利于鼻道基底组细胞扩增图片

三、条件性重编程扩增的P4呼吸道基底细胞仍然具有体外分化粘液纤毛上皮的能力

为了验证条件性重编程培养的细胞仍然具有分化的能力，作者将CRC培养的细胞在ALI分化的条件下进行培养，发现细胞形成类层级结构(图3A)。并且通过分析不同供体分化产生的分泌细胞和纤维细胞比例，作者进行免疫荧光分析(图2B-E)，通过统计发现不同供体分化的能力不同。最后，作者将CRC扩增阶段的细胞和ALI分化阶段的细胞进行比较发现，细胞由扩增进入分化过程中下调基底细胞分子标志物(Keratin5)并且上调分泌细胞标识物(MUC5B和MUC5A)以及纤维细胞的标志分子(FOXJ1)。

四、成纤维细胞对鼻道基底祖细胞形成的影响

在这里作者论证了基底细胞对基底祖细胞的影响。首先作者比较不同成纤维细胞系作为基底细胞对基底祖细胞克隆形成的影响，发现不同的成纤维细胞和肌肉细胞都能够很好的促进细胞克隆的形成(图4A)。其次，作者验证基底细胞存在的必要性，通过比较发现，缺乏基底细胞和Rock抑制剂严重抑制细胞克隆的形成(图4B)。并且基底细胞对细胞的群落的形成非常重要(图4C-F)。再者，通过利用特殊的酶移除基底细胞，作者发现与基底细胞培养的时间长短与细胞形成的克隆数呈正比，与当个克隆里细胞的数呈反比(图4G-H)。当不存在基底细胞时，细胞密度和克隆数明显下降(图4I-N)。

五、条件性重编程扩增鼻道基底祖细胞克隆的形成依赖于Y-27632刺激

通过比较CRC和BEGM培养的细胞，证明条件性重编程培养能够有效促进鼻道基底祖细胞的形成。这里作者进一步论证条件性重编程条件下Rock抑制剂的重要性。增加Rock抑制剂能够有效的促进细胞的增殖效率(图5A)。Rock抑制剂能够促进单个细胞的克隆数的形成(图5B)，且Rock抑制剂的存在显著促进克隆的形成(图5C)，但是每个克隆中细胞数的多少与Rock抑制剂没有明显关系(图5D)。因此，Rock抑制剂的存在显著促进鼻道基底祖细胞克隆的形成从而促进细胞的扩增。

六、Y-27632对条件性重编程中培养的呼吸道基底细胞转录本的影响

为了进一步从机理去探索Rock抑制剂对条件性重编程的呼吸道基底细胞的影响，作者纯化第二代使用或者不使用Rock抑制剂培养的8天后的呼吸道基底细胞进行RNAseq分析，发现Rock抑制剂能够有效改变条件性重编程细胞的转录本(图6A)。进一步对差异基因进行GO分析细胞成分(图6B)和分子功能分析(图6C)，发现大部分Rock下游基因在Rock处理后下调。此外，通过分析发现Rock抑制剂能够有效上调中间纤维基因以及桥粒基因，同时下调蛋白酶体，炎症因子和趋化因子相关基因以及细胞相互接触作用的基因。作者Rock抑制剂改变条件性重编程后细胞的胞外环境。通过检测金属酶体的活性，作者验证Rock抑制剂降低了明胶酶活性(图6E，F)，但是并没有改变胶原蛋白酶的活性而是改变胶原的的活性位点(图6E，F)。因此，Rock抑制剂改变了条件性重编程的胞外环境。

总结与讨论

本文通过条件性重编程培养呼吸道基底祖细胞，首先成功建立体外重编程培养呼吸道基底祖细胞，其次通过对比分析发现：

第一，不同成纤维细胞具有相似的促进条件性重编程细胞克隆形成能力;

第二，滋养层细胞的存在是细胞克隆形成的必要条件;

第三，Rock抑制剂的存在显著增加细胞克隆的形成;

第四，Rock抑制剂的能够改变条件性重编程细胞与胞外环境互作。

第七课：Y-27632依赖的转录组变化能够促进气管祖细胞克隆的形成

研究背景

实验结果

总结与讨论

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