研究背景
腺样囊性癌(ACC)中的唾液腺肿瘤是极其罕见的。这种肿瘤一般发生在青少年和中年人群中。虽然这种肿瘤的发生过程比较缓慢，但是其能够入侵到外周神经和血管中从而导致肿瘤的转移。对于原位的肿瘤可以采取手术切除的方法，但是应对转移的肿瘤尚未有明确报道能够有效治疗的手段。ACC中主要的特征是出现MYB激活突变，但是关于MYB激活后的下游信号分子以及肿瘤迁移相关的研究则因缺乏稳定的细胞培养系统而研究不足。为此，作者在利用病人来源的经移植到小鼠体内的肿瘤进行条件性重编程培养建立ACC细胞系，并对其进行遗传学和功能学分析。
实验结果
一、ACC细胞培养的形态学特征及其表达的表皮分子标志物
将的腺样囊性癌(ACC)细胞的体内移植培养的组织细胞体外条件性重编程培养。作者发现这类ACC组织细胞能够培养有限的代数(<15)，但是培养期间细胞形态不会发现明显改变(图1A-D)。通过免疫荧光染色发现这类细胞能够表达表皮细胞的表面分子标识物(图1E-H)。
二、ACC培养细胞中保留MYB移位以及MYB，MYC和EGFP的表达
ACC细胞主要的生物学特征在于其MYB基因的移位。作者通过FISH技术检测发现ACC11细胞中出现MYB基因转移到9号染色体并且和NFIB基因融合(图2A-B)。然而，ACC6出现MYB基因转移到1号染色体，并和TGFBR3基因的融合(图2C-D)。除此之外，通过SKY分析发现，ACC11细胞中处理6:9染色体的移位还出现其他不曾报道的染色体移位(图2A)，而ACC6则没有出去其他染色体移位(图2C)。作者检测了MYB下游的MYC的表达，发现与ACC11 PDX组织细胞和条件性重编程培养的ACC11细胞具有相似的MYC的表达水平。此外，作者也检测了EGFP的表达水平也显示其表达量相差无几(图2EFG)。
三、ACC11细胞中保留MYB-NFIB转录本及其融合蛋白
根据之前的研究报道，ACC细胞中存在MYB和NFIB基因的融合。为了检测MYB基因和NFIB基因的融合，作者设计正向特异性RT-PCR的引物检测ACC11细胞MYB基因外显子5，6和14以及反向特异性引物检测NFIB基因的外显子9。作者发现外显子5和6 PCR后的产物分别为1.4Kb和1.2Kb，则推测14号外显子与NFIB 9号外显子的应该有200bp左右。但是，结果显示有400bp，所以14号外显子前应该出现断裂(图3A)。因此，作者将图3A中第二和第四道条带送去测序，鉴定出断裂出现在MYB外显子12末端以及NFIB外显子9前(图3B)。并且，通过WB检测到ACC细胞中出现MYB-NFIB的融合蛋白(图3C)。
四、ACC11细胞和其亲本细胞表达突变的ATM和FGFR2转录本
作者通过二代测序鉴定ACC11细胞，发现细胞中出现原癌基因的突变：ATM和FGFR2的非同义的点突变(图4A和C)。并且这种点突变同样存在于PDX的组织细胞中(图4B和D)。因此，条件性重编程培养很好的保持了细胞应有的遗传学特征。
五、ACC11细胞维持转化和扩散能力
作者利用琼脂分析实验发现ACC11细胞培养7天可以形成小的细胞克隆，但是培养27不会形成肉眼可见的细胞克隆，表明ACC11细胞具有一定转化能力但是相较于A253细胞较弱(图5A)。此外，作者检测了细胞的扩散到表皮细胞的能力，通过检测表皮细胞HUVEC的电阻变化发现ACC11能够浸入到表皮细胞HUVEC中(图5B)。
六、ACC11细胞在斑马鱼体转移模型中仍保持其转移能力
作者通过斑马鱼模型检测ACC11细胞是否保持体内的转移能力。作者将ACC11细胞在斑马鱼卵细胞受精后的第二天注入到卵黄中。其中ACC11细胞是利用红色染料标记，通过检测ACC11细胞是否转移到斑马鱼的头部和尾巴作为检测标准。通过检测发现ACC11细胞能够转移到斑马鱼的尾部而对照组则不能(图6)。
七、ACC11和ACC6细胞在体外以及斑马鱼实验中仍具有相似的药物敏感性
在以上的研究基础上，作者利用体外条件性重编程的细胞对目前临床用于治疗头颈以其其他肿瘤的药物进行筛选。首先通过体外的筛选发现Regorafenib(癌瑞格)能够有效抑制ACC11和ACC6细胞的生长(图7A-D)。其次，作者利用斑马鱼模型研究该药物对细胞转移的影响，发现癌瑞格能够有效抑制ACC11和ACC6细胞在斑马鱼体内的转移(图7E-H)。
总结与讨论
作者通过体外条件性重编程培养已建立的唾液腺体囊性癌的PDX组织细胞获得ACC细胞系。通过对ACC细胞进行鉴定分析，作者除验证之前已经报道的基因融合和染色体移位外还发现其他的染色体的移位和基因突变。而且，通过利用斑马鱼系统分析ACC癌细胞的迁移。最后通过体外的药物筛选和斑马鱼模型验证得出癌瑞格作为潜在的药物能够抑制ACC细胞生长和迁移。
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