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hESC/iPSC相关产品
hESC/iPSC细胞铺板工作液
hESC/iPSC细胞铺板工作液
hESC/iPSC细胞铺板工作液

hESC/iPSC细胞铺板工作液

货号:IMC-014-P

价格:
 880元

规格:

货期:现货

  • 产品信息

hESC/iPSC细胞培养试剂盒说明书下载

一、产品介绍

铺板工作液(hESC/iPSC Planking Solution)是使用VTN 包被蛋白(Vitronectin)配制的即用型工作液,VTN是一种成分确定的,无异源成分的细胞基质,能够支持hESC/iPSC的生长和分化,可以与多能干细胞完全培养基一起使用,用于hESC/iPSC体外无饲养层培养。

二、产品信息

表 1: hESC/iPSC 完全培养基 试剂盒产品内容

产品信息货号规格储存条件
hESC/iPSC 细胞培养基试剂盒IMC-0141 Kit2℃~-20℃
hESC/iPSC Basal MediumIMC -014-M400mL2℃~8℃

hESC/iPSC Grouth SupplementsA

IMC-014-A20mL-20℃ or -80℃

hESC/iPSC Grouth Supplements B

IMC-014-B80mL-20℃ or -80℃
hESC/iPSC Supplement CIMC-014-Y1.5mL-20℃ or -80℃

表 2: hESC/iPSC 其他相关试剂 产品内容

产品信息货号规格储存条件
hESC/iPSC Passage SolutionIMC-014-E500 mL2℃~8℃
hESC/iPSC Cryopreservation SolutionIMC-014-S50mL2℃~8℃
hESC/iPSC Planking Solution SupplementIMC-014-P-11.2mL-20℃ or -80℃
hESC/iPSC Planking Solution Basal MediumIMC-014-P-290mL2℃~8℃

三、试剂材料

表 2:其他试剂&材料

试剂&材料品牌货号
DMEM/F12 培养基IMMOCELLIMC-205
6/12/24 孔板----

1 mL/5 mL/10 mL/25 mL 移液管

----

15 mL/50 mL 离心管

----
1.5/2 mL 冻存管----
梯度程序降温盒----

四、 试剂准备

1 )hESC/iPSC 完全培养基配制(500 mL )

1. 在 4℃条件下解冻 hESC/iPSC Grouth SupplementsA/B,勿在 37℃培养箱/水浴锅解冻。

2. 参考表 表 3 在生物安全柜中,使用无菌移液管混匀下列成分配制成 hESC/iPSC 完全培养基,之后置于 4℃储存,封口膜封好后 2 周内使用。

3. 有初培养需扩建的需求,建议先配置 100 mL,保证 2 周内使用完毕。

表 3:hESC/iPSC 完全培养基配置说明*

组分500 mL100 mL50 mL
hESC/iPSC Basal Medium400 mL80 mL40 mL
hESC/iPSC Grouth SupplementsA20 mL4 mL2℃~8℃

hESC/iPSC Grouth Supplements B

80 mL16 mL8 mL

可根据实际用量将 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 分装后冷冻保存。具体配置比例可参考表 3 的配置说明。hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 冻融总次数不能超过 2 次。

2 )Matrigel 铺板(以货号为 354277 的 的 Corning® Matrigel® 包被 6 孔板为例 )

A. 装 分装 Matrigel

1. 货号 354277 的 Matrigel,操作说明中不标注蛋白浓度,而是以 Dilution Factor 表示,如某批次的推荐 Dilution Factor 为 278 μL,则表明 278 μL 可包被 4 块 6 孔板,分装数量=5 mL/0.278=17.98。

2. 准备 18 个无菌 1.5 mL EP 管,标记 Matrigel 日期、操作人;1mL 无菌吸头;EP 管架,均置于-20℃冰箱中预冷 1 小时。

3. 将 Matrigel 放置 4℃冰箱过夜解冻,当 Matrigel 完全解冻即可开始分装。

注:在解冻时,将 Matrigel 放置冰箱内侧角落,切勿放在靠近冰箱门附近。

4. 准备一个装满碎冰的冰盒,将解冻过的 Matrigel、预冷的 1.5 mL EP 管及 EP 管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。

5. 混匀 Matrigel,无菌分装于各个 1.5 mL EP 管中,并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。

6. 将分装后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。

B. 铺板

1. 取 36 mL 冷藏 DMEM/F12 于 50 mL 离心管中,准备 4 个 6 孔板,标记 Matrigel、批号、日期和操作人。

2. 1 mL 无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷 1 小时,取出一支冷冻的 Matrigel(5mL)置于 4℃冰箱解冻至完全化冻。

3. 准备一个装满碎冰的冰盒,将解冻过的 Matrigel、预冷的 1mL 吸头放置于生物安全柜上。

4. 用预冷的吸头向解冻过的 Matrigel(5mL),加入 1 mL 冷的 DMEM/F12 反复吹打解冻并混匀。

5. 吸出已解冻混匀的 Matrigel 加入离心管中剩余的 DMEM/F12,使用 10 mL 移液管再次反复吹打混匀。

6. 分装 1.5 mL/孔于 4 个六孔板中,轻轻摇晃混匀。

7. 培养板置于室温 1 小时后即可使用,或置于 4℃冷藏过夜,两周内使用。

五 、 复苏 hESC/iPSC (以 6 孔板为例)

1. 将水浴锅预热至 37℃。

2. 将 Matrigel 包被的 6 孔板,提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温(15~30℃)。

3. 取 4 mL hESC/iPSC 完全培养基,按照 1:4000 比例加入 1 μL 的 hESC/iPSC Supplement C,恢复至室温(15~30℃)。

TIPS:不要在 37℃水浴锅中预温培养基。

4. 取出 1 支冷冻的细胞置于 37℃水浴锅手持轻轻摇晃,2 min 内解冻,肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出。

5. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面,转入生物安全柜;将细胞悬液移到事先准备好的 15 mL离心管中,随后逐滴加入 10mL DMEM/F12,过程中轻柔晃动混匀细胞,160 g 离心 5 min。

6. 吸弃上清,加入预温的 4 mL 的 hESC/iPSC 完全培养基混匀细胞,尽量避免吹打。

注:可留 20 μL 上清液,轻弹管底,使细胞悬浮液更均匀,避免成较大细胞团。

7. 吸除 6 孔板中 2 孔的 Matrigel 包被液,将混匀的细胞按照 2 mL/孔接种到 2 孔中。

8. 水平十字摇匀三次,置于 37℃,5% CO 2 浓度,饱和湿度的培养箱中,再次水平十字摇匀三次培养。

9. 18-24 小时后换新的 hESC/iPSC 完全培养基,之后每天更换培养基。

注:在 hESC 培养过程中,如果细胞的汇合度超过 50%,建议更换培养基时,培养基的体积增加至 3-4mL/孔。

表 4: hESC/iPSC 传代&培养操作试剂推荐用量

hESC/iPSC 传代&培养操作试剂推荐用量图

六 、传代 hESC/iPSC (以 6 孔板为例)

1. 传代条件:① 细胞汇合度达 85%左右(如图 1(C-D)所示),一般情况下每 3-4 天传代;

② 细胞汇合度较低,生长密度分布不均匀。

注:即使克隆团较小、汇合度不足,也建议不要连续培养超过 5 天。

2. 传代比例:可根据细胞生长状态和实验需要按 1:5~1:12 的比例进行传代,如果细胞正常,克隆团汇合度 85%,大小均匀(如图 1(C-D)所示),建议按照 1:8 进行传代,如果密度偏低,则可降低传代比例;密度偏高,则增加传代比例。

注:1:8 传代就是 1 个孔瓶传 8 个孔(以 6 孔板为例)。

3. 将 Matrigel 包被的 6 孔板,提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温(~25℃)。

4. 根据传代接种的孔数准备 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培养基,并按 1:4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C( IMC-014-Y) ,恢复至室温(~25℃)。

图 1.hESC/iPSC 完全培养基连续培养 hESC 细胞形态图

图 1.hESC/iPSC 完全培养基连续培养 hESC 细胞形态图 :(A )和(C ) 分别为 hESC 细胞培养第 2 和 4

天时 低倍镜 hESC 培养 形态图示, (B )和(D ) 为培养至第 2 和 和 4 天时的 高倍镜 hESC 培养 形态图。

5. 将 Matrigel 包被的 6 孔板,提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温(~25℃)。

6. 根据传代接种的孔数准备 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培养基,并按 1:4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C,恢复至室温(~25℃)。

7. 将孔内培养基吸取,加入 2 mL/孔的 DPBS(不含钙镁),轻轻摇晃并吸取。

8. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution 使溶液完全覆盖孔底。

9. 置于 37℃培养箱中孵育 8-9 min。

注:① 消化 8-9 min 后镜下观察细胞变化,当大部分细胞变亮变圆,且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化,若大部分细胞仍未变亮,则需要延长消化时间;

② 保持 6 孔板与培养箱金属隔板直接接触,使 6 孔板受热均匀,不要叠放。10. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜,避免震荡摇晃细胞,倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

11. 及时加入 2 mL/孔预温的 hESC/iPSC 完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C,水平十字摇晃 6 孔板使细胞脱离基质。

注:① 加 hESC/iPSC 完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 时,可轻柔吹打细胞 1-2 次,不能超过 2 次,避免反复吹打;有部分细胞(10%~15%)未脱离基质是正常现象,若有大量细胞未脱离则需延长消化时间(< 10min)。

② hESC 不能长时间处于 hESC/iPSC Passage Solution(<15 min),所以收集接种细胞时操作必须快速,以及最好一次操作不要超过 4 孔(六孔板)。

消化 hESC 细胞不同时间 形态图

图 2 : 消化 hESC 细胞不同时间 形态图 : (A ) 消化 8 min 低倍镜 hESC 培养的 的形态图; (B ) 消化 9 min

低倍镜 hESC 培养的 的形态图。

12. 吸取 6 孔板中的 Matrigel 溶液,加入预温的 hESC/iPSC 完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

13. 在 6 孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤 9 获得的细胞悬液轻轻摇匀,按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。

注:为了铺板均匀并降低对细胞的损伤,可以将步骤 9 获得的细胞悬液收集至 2 mL 离心管,轻柔颠倒混匀细胞 1-2 次;再按照传代比例接种。

14. 接种后,水平十字摇匀 6 孔板三次,置于 37℃,5% CO 2 浓度,饱和湿度的培养箱中, 再次水平十字摇匀 6 孔板三次,培养过夜。

15. 18-24 小时后更换新 hESC/iPSC 完全培养基,此后每天换液,4-5 天后继续传代/冻存。

七、冻存 hESC/iPSC

1. 当细胞汇合度达 85%左右(如图 1(C-D)所示)可收获冻存,一般 6 孔板每孔可冻存 1 管。

2. 准备相应数量的 1.5/2 mL 冻存管,标记细胞名称、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出 4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution,置于室温预温,使用前注意 摇匀。

4. 吸取上清液,加入 2 mL/孔的 DPBS(不含钙镁),轻轻摇晃数次,再吸取。

5. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution,将细胞置于 37℃培养箱中,计时 8-9 min(可

参考“ 六、传代 hESC/iPSC”步骤)。

6. 消化结束,轻轻取出培养板,吸取 hESC/iPSC Passage Solution。

7. 摇匀预温的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution,每孔加入 1 mL 冻存液,轻柔吹打,水平十字摇匀 3 次,随后吸取细胞悬液加入 1.5/2 mL 冻存管中。

8. 将细胞置于梯度程序降温盒中,并置-80℃冰箱中过夜,次日转入液氮罐中长期保存。

八、其他培养体系中 hESC/iPSC 更换为 hESC/iPSC 完全培养基条件的适应

其他无饲养层条件培养的 hESC/iPSC 可以在细胞状态良好时,使用原培养基进行细胞传代,24 小时后更换成混合培养基(原培养基与 hESC/iPSC 完全培养基按照 1:1 混合)培养,培养 2 代后完全换成 hESC/iPSC 完全培养基培养,培养 2-3 代后可完全适应新的培养体系,此时可进行细胞冻存处理。

细胞培养操作视频

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