逸漠Cell Counting Kit-8(CCK-8 试剂盒)说明书下载
产品简介
Cell Counting Kit-8，简称CCK-8（或CCK8）试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测试剂盒。其检测原理在于，在电子耦合试剂存在的情况下，检测试剂中的WST-8化合物被活细胞内脱氢酶还原成具有水溶性的橙黄色甲臜化合物,该物质在450 nm处有最大吸收峰。甲臜量与活细胞数成正比，即细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。
WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT 被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可 以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳 定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比线性范围更宽，灵敏度更高。WST-8和WST-1相比，检测灵敏度更高，更易溶解，并且更加稳定。
本试剂盒中WST-8对细胞无明显毒性，可以用于外源细胞因子等诱导的细胞增殖检测，以及药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测，是MTT检测方法的升级版。
本试剂盒使用便捷，无需配制或稀释，无需收集或洗涤细胞，无需对甲臜化合物进行再次溶解，对贴壁细胞及悬浮细胞均适用。且酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。
使用说明
1.制作标准曲线（测定细胞具体数量）
（1）先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。
（2）按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。
（3）接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。）
2.细胞活性检测
（1）在96孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37℃,5% CO2）。
（2）向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
（3）将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
（4）用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
（5）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
3.细胞增殖-毒性检测
（1）在96孔板中配制100 μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时（37℃， 5% CO2）。
（2）向培养板加入10 μL不同浓度的待测物质。
（3）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。
（4）向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。
（5）将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
（6）用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
（7）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
4.活力计算：
细胞活力（％）=[A(加药)－A(空白)]／[ A(0 加药)－A(空白)]×100
A（加药）：具有细胞、CCK-8 溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和 CCK-8 溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0 加药）：具有细胞、CCK-8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
注意事项
1.本试剂盒检测原理是依赖于脱氢酶催化的反应，样品中如有较多还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，需设法去除。
2.建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
3.白细胞可能需要培养较长时间。
4.当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1 ,000 个/孔 (100 µL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔 ( 100 µL 培养基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK-8 溶液。
5.如果没有 450 nm 的滤光片，可以使用吸光度在 430-490 nm 之间的滤光片，但是 450 nm 检测灵敏度最高。
6.培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
7.由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈 最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸 发。
8.加检测试剂时避免产生气泡，否则会干扰检测结果。
9.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
10.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
本产品仅用于科研用途，不可用于诊断、治疗、临床、家庭及其他用途。
