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第三节:人脐静脉内皮细胞原代分离,鉴定及培养

时间:2023-04-25 15:27:30 点击:354次

细胞简介

人脐静脉内皮细胞分离自脐带组织,它是脐静脉的重要结构组成细胞之一,在机体的正常生理过程中发挥着重要作用。脐带是哺乳类的连接胎儿和胎盘的管状结构,脐带中通过尿膜的血管即脐动脉和脐静脉,卵黄囊的血管即脐肠系膜动脉及脐肠系膜静脉。在子宫中,子宫动脉在胎盘的母体部分出的毛细血管,与胎盘的子体部胎儿毛细血管靠近,在此处母体和胎儿的血液间进行CO2和O2,代谢产物即代谢废物和营养物质的交换。脐动脉将胎儿产生的废物运送至胎盘,脐静脉将O2和营养物质从胎盘运送给胎儿。

材料准备

试剂:PBS,胰酶,ECM完全培养基,HUVEC专用消化酶,脐带运输保存液

器械:注射器,手术钳,T25培养瓶,玻璃大皿,灌胃针

操作流程

实验准备

提前将使用手术钳,灌胃针及玻璃大皿高温灭菌,准备所需要的分离试剂。

1.将 15-20 cm 长的新生儿脐带放入无菌的 PBS 溶液(添加双抗和肝素钠)中储存。(注:4℃下最多贮存 24 小时,室温下不超过 6 小时,否则废弃)

2. 使用50ml注射器,每次可以灌满新鲜PBS后可以用止血钳夹住脐带两端,轻缓揉捏,将脐带内的血块化开,方便冲洗干净。

3. 用手术钳夹紧脐带下端,加入 15 mL (灌满为标准)的HUVEC专用消化酶,室温下消化 15-20分钟,有条件的话放置到37摄氏度的环境中,消化期间经常翻动脐带,使酶溶液在血管内流动,促使内皮细胞与酶均匀接触。

4. 消化完后,先用钝头针头疏通下端流出口,防止阻塞,将下端手术钳松开,消化液流入一个 50 mL 无菌离心管中,管内要有部分全培养基,或者纯血清,用无菌的 PBS 溶液冲洗脐带2-3次,每次都要用手轻微揉动。

5. 将收集液,置于离心机1000 rpm 离心3分钟。

6. 倒去上清,加入 10 mL ECM培养基,用巴氏管吹散细胞,将所有液体转入T25培养瓶中,37℃培养。

7. 培养24小时后,倒掉培养基,并用无菌的 PBS 溶液清洗2-3次,洗掉红细胞和死细胞,加入10 mL新鲜的ECM培养基。

8. 以后每2天换一次培养基(每次换掉 2/3 的培养基)。

9. 一般培养5-7天,细胞可长满至 80-90%单层,这时可以传代。

细胞传代

1. 倒掉培养基,用无菌的PBS溶液清洗2-3次,加入2- 3 mL 消化液(0.25% 胰酶+0.1% EDTA)消化细胞,在显微镜下观察,一旦细胞变圆,即加入2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。

2. 用巴氏管将细胞吹打下来,并将所消化的细胞转移到一个 50 mL无菌离心管中,置于离心机1000 rpm离心 3 分钟。

3. 倒掉上清,加入 10 mL新鲜培基,一般一瓶细胞可传代 3-4 瓶,以后照此传代培养。

4. 一般传代 2-3 代(培养了 20 天左右)用于做各种实验效果最好。P6代以内实验结果收到认可。

细胞鉴定

1. 形态学观察

细胞贴壁生长,呈短梭形或铺路石样向前排列,上皮细胞样。

2. 标记物检测

一般的标准为VWF,CD31,VIMTENMIN为阳性(>95%)

3. 诱导实验


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