逸漠生物构建可靠的细胞资源平台。涵盖细胞系、原代细胞、标记细胞、耐药细胞及培养相关产品
细胞资源平台
咨询热线:400-080-3389
您的位置: 首页>>细胞培养视频
细胞培养视频

第四节:小鼠小肠类器官复苏教程

时间:2023-05-27 09:19:28 点击:313次

复苏小肠类器官(以24孔板培养为例)

一、准备工作

1. 将恒温水浴锅调至37℃预热,根据实验用量,提前解冻分装好的基质胶。

2. 准备200 μL无菌吸头1盒,无菌的1.5 mL EP管,放入EP冰盒上,均置于-20℃冰箱中预冷1小时以上;

3. 取15 mL离心管,并做上标记;吸取10 mL DMEM/F12 培养基加到离心管中;

4. 取15 mL离心管,并做上标记;吸取1 mL Immocell MLDT organoid 完全培养基加到离心管中;按照1:1000比例加入1 μl的Immocell Y-27632(10 mM),充分混匀,恢复至室温;

注意:不要在37℃水浴锅中预温培养基

二、小肠类器官细胞复苏

1.从液氮罐中取出待复苏的小肠类器官细胞,转移置于干冰泡沫箱中,取出一支待复苏的小肠类器官细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃,2 min内解冻,肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出;75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面,放入生物安全柜;

2.将类器官细胞悬液移至15 mL离心管中,随后缓慢加入10 mL DMEM/F12,轻柔晃动混匀细胞,200-300 g离心3-5 min;

3.离心完后可看到离心管底部有细胞沉淀,将离心好的细胞置于生物安全柜中,吸弃上清,尽量吸尽,但是注意不要吸起细胞沉淀,加入预温的1mL Immocell Reactive detergent medium,重悬细胞沉淀,200-300 g离心3-5 min;此步骤重复2次,以除去残留冻存液。

4.按照每孔500-2000个隐窝对应25 μL Matrigel的比例计算加入相应的基质胶,重悬后置于冰上,重悬时间不超过30s以避免基质胶过早凝固。

5. 用移液器吸取Matrigel和细胞的混合液移至细胞培养孔板中(24孔板每孔点加25uL),混合悬液须点至培养孔底部中央,沿着边缘铺开,其铺开后不可接触培养孔侧壁。

6.将培养板放入37℃,5% CO2细胞培养箱中凝固10-15min,待基质胶凝固至不流动后,沿着孔壁缓慢加入Immocell MLDT organoid 完全培养基,每孔加500 μL,做好标记(日期,代次,操作人),每2天更换培养基。

7.将细胞培养板放入培养箱中进行培养,每2天于显微镜中观察小鼠小肠类器官的生长状态并拍照,记录多个视野中的小鼠小肠类器官的形态和分布。

三、注意

在Matrigel点加至培养板中时,要记得沿着胶滴边缘铺开,保证中心和边缘胶的均匀性,否则会由于营养的吸收不均一,导致小肠类器官培养生长状态不一致。

在显微镜下观察,小肠类器官形态表面边缘清晰,而表面有出现松散裂解的状态则为死细胞或活力较低的细胞。

热门产品推荐

大家都在看

版权说明:本文:“第四节:小鼠小肠类器官复苏教程:http://www.immocell.com/xbpyvideo/4326.html”,若本站收录的信息如有侵权,请给我们来信(im@immocell.com),我们将及时处理。