悬浮293T人肾上皮细胞系

1.复苏前15min,取25ml无血清培养基到125ml摇瓶中，并放37度预温备用；

2.水浴锅开37度；

3.根据冻存的细胞密度选择适当的复苏体系，使复苏培养的起始细胞密度控制在 0.3-0.4×10⁶ cells/mL。

以 125 mL 培养瓶（25 mL 体系，冻存管中细胞数量为 1×107 cells）举例说明如下：

l 迅速取出冻存的细胞，在 37℃水浴解冻（可以在水中轻轻晃动，时间控制在 1 分钟内）；

l 对冻存管表面消毒；向 125 mL 培养瓶中加入 25 mL 的新鲜 培养基，将融化的细胞全部转入培养瓶中， 轻轻摇动培养瓶混匀细胞。由于刚复苏的细胞比较脆弱， 所以整个过程应避免剧烈操作且无需离心细胞；

l 将重悬好的细胞置于 37℃，5% CO₂，150-175  rpm转速的恒温摇床中培养；

l 监测培养 2-5 天内的细胞密度以及活率数据

l如果细胞密度达到 1.0×106 cells/mL，且活率达到 85% 以上则可进行正常传代培养；

l如果细胞密度达不到 1.0×106 cells/mL，或活率低于85%，则对细胞进行离心（100 g 离心 5 分钟）， 用适量的新鲜培养基重悬细胞沉淀至活细胞密度为 0.4-0.6×10⁶ cells/mL，转移到适宜容器中继续培养；

l如果细胞密度达不到 1.0×10⁶ cells/mL，且活率低于 70%，则建议重新复苏细胞。 注意:若冻存管中的细胞数量较少（5×10⁶ cells），可以选择用 50 mL 离心管进行复苏，摇床转速为 175-200 rpm。

注意：细胞传代所用的 培养基体积不超过容器体积的20%。

1. 计数细胞，计算细胞密度和细胞活率；

2. 将细胞以 0.3-0.4×10⁶ cells/mL 的起始密度接种到新鲜培养基中；

3. 将培养瓶置于 37℃，5% CO₂，150-175 rpm 转速的恒温摇床中培养；

4. 传代培养 3-4 天后，活细胞密度一般能达到 3×10⁶ cells/mL 以上，且活率大于 90%。 注意：建议对新复苏的细胞传代两次以上（一般复苏传两代以上细胞活力可达95 %以上，3天密度可达2.0-4.0×10⁶ cells/mL），待其从冻存损伤中彻底恢复后再进行转染、冻存等实验操作，复苏后的细胞使用代次建议为30代以内

选择处于对数生长期（一般为正常传代后第 3 天）且细胞活率在 90%以上的细胞直接用 90%FBS+10%DMSO 进行冻存，最终的活细胞冻存密度为 5-10×10⁶ cells/mL。

操作步骤如下：

1. 计数细胞，根据细胞数量计算所需的冻存体积；

2. 将 90%FBS和 10% 冻存体积的 DMSO 混匀配制好后置于 4℃冰箱备用；

3. 离心适量细胞（100 g 离心 5 分钟）后去除上清并用配制好的细胞冻存液重悬细胞；

4. 混匀细胞并将其移至冻存管中，每管 1 mL 细胞。将细胞冻存管放到事先预冷（4℃过夜）的程序降温冻存盒中，置于-80℃冰箱(程序降温盒每分钟下降 1℃)内过夜；

5. 如需长期存放，可以转移到液氮灌中。

注意:冻存前一天，检查冻存盒夹套中的异丙醇液位合格，放在 4℃冰箱预冷。冻存操作 24 小时后可以抽样复苏-80℃ 冰箱或者液氮中的冻存细胞，从而检测细胞的冻存效果。

1. 收到活细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，干冰运输的细胞检查干冰是否完全挥发，细胞是否解冻，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。

5. 该细胞仅供科研使用。

1.细胞运输途中遭遇的各种问题，细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，重发；

2.收到细胞未开封，如出现污染状况，重发；

3.收到细胞3天内，发现污染问题，经核实后，重发；

4.常温发货的细胞静置 2 小时后，干冰冻存发货的细胞复苏 2 天后，绝大多数细胞未存活，经核实后，重发；

5.常温发货的细胞静置 22 小时并且未开封或干冰冻存发货的细胞复苏 2 天后，出现污染，经核实后，重发；

6.细胞活性问题，请在收到产品 3 天内给我们提出真实的实验结果，用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，经核实后，重发；

7.视具体情况而定。

1.客户操作造成细胞污染，不重发；

2.客户严重操作失误致细胞状态不好，不重发；

3.非我们推荐细胞培养体系致的细胞状态不好，不重发；

4.细胞状态不好，未提供真实清晰的培养前 3 天的细胞状态照片，不重发；

5.细胞培养时经其它处理导致细胞出现问题的，不重发；

6.收到细胞发现问题与客服人员沟通的时间证明大于3天的，不重发；

7.视具体情况而定。