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实验技术指南

SV40 T抗原对未成熟和成熟小鼠星形胶质细胞的永生化

时间：2022-10-14 10:46:59 点击：737次

写在前面

今天推荐的是由美国阿尔伯特爱因斯坦医学院在2021年发表于Journal of Neuroscience Research(2021 IF4.433, JCR/Q2)的一篇文章，通讯作者是J. Silver 教授和 J.W. Jacobberger教授。

文章摘要

随着星形胶质细胞的成熟，新生星形胶质细胞在体外和体内促进神经突生长的能力减弱。此特性与受伤后中枢神经系统再生能力的发育丧失有关。代表未成熟和成熟星形胶质细胞的细胞系将有助于研究确定这两个群体之间的差异。先前关于双能神经/神经胶质前体和完全分化的神经胶质细胞永生化的工作表明，在培养的定时间隔内星形胶质细胞的永生化可能会产生陷入不同成熟状态的细胞系。为了测试一下这一点，在培养的第2、6和17天，通过逆转录病毒介导的SV40 T抗原 (Tag) 基因的转移使新生小鼠皮质星形胶质细胞永生化。克隆细胞系表达标签并受到接触抑制。检查了随星形胶质细胞成熟而变化的三种表型，以确定细胞系代表未成熟和成熟星形胶质细胞的保真度。这些是 :( 1) 细胞形态，生长模式和大小，(2) 神经胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 表达水平，以及 (3) 神经突生长促进。首先，在形态和生长模式方面，未成熟和成熟的品系类似于相应年龄的凡人1型星形胶质细胞，并保留了细胞大小的定量差异 (成熟细胞较大)。其次，GFAP表达的模式得以保留，未成熟细胞系的表达水平低于成熟细胞系，但与凡人细胞相比，永生化细胞系的总体GFAP水平显着降低。最后，检查了胚胎雏鸡视网膜神经节细胞在细胞系单层上的神经突生长的促进作用。尽管永生化品系的所有神经突生长指标均明显大于对照3T3细胞，但相对于凡人星形胶质细胞，它们的衰减。未成熟星形胶质细胞上更强的生长支持的年龄相关模式保留用于神经突起始，但不保留平均神经突长度。因此，SV40标签永生化的星形胶质细胞具有复杂的表型，其特征是在形态，生长模式和细胞大小方面保留与年龄相关的差异0 1994 Wiley-Liss，inc.，并且通过某些星形胶质细胞特异性特征的显着减弱，但是保留了与年龄相关的这些相同特征的表达水平差异，最后，在未成熟星形胶质细胞的特征性水平上失去了支持神经突延伸的能力。

研究背景

永生化癌基因的表达会改变细胞增殖，但保留了明显程度的细胞类型特异性表型。终末分化的永生化细胞保留细胞特异性特征，即星形胶质细胞表达胶质丝蛋白，上皮细胞表达细胞角蛋白等。然而，在永生化时进行分化的细胞似乎被困在其正常分化途径的分支点或节点上。在神经系统中，保留亲本细胞特征的癌基因永生化细胞系已经从神经元/神经胶质前体、星形胶质细胞、雪旺细胞和小胶质细胞产生 (关于评论，参见Cepko，1989; Geller等，1991; Lendahl和McKay，1991)。在发育早期永生的神经细胞具有强大的能力，并在适当的刺激下保留了分化的潜力。例如，神经前体细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞 (Ryder等人，1990) 和双势胶质细胞系可以分化为少突胶质细胞和星形胶质细胞 (Evrard等人，1988)。

在啮齿类动物中的损伤和移植实验提供了证据，表明1型星形胶质细胞在出生后短时间内支持中枢神经系统 (CNS) 再生，但后来变得不支持 (Smith等，1986; Schreyer和Jones，1987; Smith和Silver，1988)。星形胶质细胞表型的这种变化已经在体外通过将神经元接种到从不同老年动物培养的星形胶质细胞上并测量神经突延伸来测定 (Rudge和Silver，1990; Geisert和Stewart，1991; McKeon等，1991; Sagot等，1991)。在细胞培养过程中，未成熟的新生星形胶质细胞的神经突生长支持也逐渐减少，成熟的星形胶质细胞在大鼠中老化28天 (Fawcett等人，1989; Smith等人，1990) 或在小鼠中老化7天 (Frisa和Jacobberger，1991) 促进未成熟星形胶质细胞水平在50-70 '321生长。最近的工作表明，在此期间，几个分子的表达发生了显著变化 (Da Cunha等人，1991; Frisa和Jacobberger，1991; Smith等人，1993)。这种变化的动力学是明确定义的，并且看起来是细胞自主的，即，在体内和体外的表达的时间依赖性模式看起来是相同的 (Smith等人，1 993)。

由于星形胶质细胞已被SV40 T抗原 (Tag) 表达永生化，并且由于永生化已被证明在双分化的特定阶段诱捕细胞，因此我们在不同的出生后时间将培养的星形胶质细胞永生化，以询问Tag是否可以在未成熟和成年阶段固定星形胶质细胞。此外，定量评估星形胶质细胞特征在永生化细胞系中保留的程度将为使用这些细胞系的研究以及改善永生化载体的努力提供基础。新生小鼠皮质星形胶质细胞在体外老化2、6和17天，用编码标签的逆转录病毒载体永生化，然后克隆。测量细胞形态和大小，神经胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 表达水平以及神经突生长促进作用，并将其与原代星形胶质细胞进行比较，以评估成熟停滞的程度和星形胶质细胞表型保留的保真度。

研究内容

1.SV-40标签永生化CNS细胞系的表征

来自SV40-6细胞的含有逆转录病毒的上清液用于将野生型SV40大标签基因转移到已在体外培养2、6或17天的新生小鼠皮质星形胶质细胞 (分别称为PO2D、PO-6D和PO-17D细胞)。用G418选择后分离出单个菌落，然后扩增并鉴定。所有细胞系均表达标签 (表I)。通过细胞提取物的免疫印迹或通过在玻璃盖玻片上生长的细胞的免疫染色来确定星形胶质细胞系的GFAP表达 (图1)。26个品系中只有2个与单克隆GFAP抗体反应 (表I)。没有细胞系与A2B5抗体或Gal-C抗体反应。GFAP的存在和其他标记物的不存在证实了细胞系的星形胶质谱系，并且排除了成纤维细胞、2型星形胶质细胞、02A祖细胞、少突胶质细胞或小胶质细胞 (Anderson，1989)。

图1.星形胶质细胞系的GFAP表达。永生化的细胞 (例如该PO-17D系) 结合单克隆抗GFAP，尽管单个细胞的GFAP荧光强度不同。

2. 星形胶质细胞系的形态和生长模式

在形态上，细胞系类似于1型星形胶质细胞。当它们亚汇合并生长形成多边形细胞的平坦单层时，它们通常是星状的 (图2)。在早期培养时永生化的细胞 (图2A) 比在后期永生化的细胞 (图2C) 显得更小、更少粘附、更细长，并且保持更少的细胞间接触。在融合培养中，未成熟的细胞系比成熟的细胞系更紧密地堆积，并且细胞趋于排列 (图2B和D)。这些变化与培养过程中初级星形胶质细胞发生的形态变化相似。

当培养PO-2D和PO-6D品系与PO-171品系相比时，观察到明显的区别。虽然所有细胞系都显示出接触生长抑制，但PO-17D细胞系通常在5-7天内形成稳定的单层，可以无限期地维持而不传代，很像成熟的原代星形胶质细胞。较年轻的永生化年龄组 (PO-2D和PO-6D) 的接触抑制程度低于PO17D细胞系，必须经常传代以维持生存能力。因此，与较老的细胞系相比，年轻的细胞系的生长特性发生了更大的转化。尽管由于成熟的快速动力学，这种差异对于致命的星形胶质细胞很难测量，但与成熟的原发性星形胶质细胞相比，原发性未成熟星形胶质细胞似乎更具流动性，呈纺锤形，并且接触抑制程度较低。

为了验证细胞系的视觉大小差异，我们测量了胰蛋白酶-dissoci的直径相衬光学下的细胞。选择DNA含量为二倍体的细胞系进行比较，因为细胞大小与DNA含量成正比 (Jacobberger，未发表)。二倍体PO-2D系的直径为13.25 2 2.06千米 (n = 211)，二倍体PO:17D系的直径为17.87 2下午4:11 (n = 201) (用于直径比较，P = 3.3e-59)。部分为四倍体的细胞系直径较大 (如预期的那样); 但是，当估计非整倍性的比例并用于校正体积差异时，这些细胞系在幼株和成熟株之间显示出相似的直径差异。培养过程中初级星形胶质细胞的直径呈线性增加。在2至17天之间，增加42%，这与成熟细胞系的35% 大直径相当。2天和17天细胞系的直径均适度大于相应的原代星形胶质细胞 (7-12% 差异)。因此，细胞系比原代星形胶质细胞稍大，但在永生化时保留了亲代星形胶质细胞固有的大小差异。

图2.星形胶质细胞系的形态。以低密度和高密度培养PO-2D (A和B) 和PO-17D (C和D) 细胞系，并用相衬光学器件观察。亚融合细胞 (A和C) 为星状和融合细胞 (B和D) 形成类似于原代小鼠星形胶质细胞的扁平单层。与PO-17D细胞相比，PO-2D细胞更小，更折射并且具有更少的细胞间接触。

3. 细胞系中GFAP的表达维持与年龄相关的差异

基于细胞系提取物的免疫印迹的观察表明，最高的GFAP水平出现在培养6天和17天永生化的星形胶质细胞中，这与初级星形胶质细胞中GFAP表达的变化一致 (Chiu和Goldman，1984; Frisa和Jacobberger，1991)。为了证实这一观察结果，使用单克隆GFAP抗体通过流式细胞术定量测量了2天和17天星形胶质细胞系中的GFAP表达。NIH 3T3细胞在细胞提取物的免疫印迹或流式细胞仪上分析时均未与该抗体反应。在一个实验中，通过流式细胞术分析了所有2天和17天的品系，并平均了每个年龄组的阳性荧光值。在单独的实验中，使用单个细胞系作为染色标准，对原代星形胶质细胞进行了测定。17天细胞系的GFAP比2天细胞系高11倍 (表11)。老年原代星形胶质细胞抗GFAP的4.5倍反应性比未成熟细胞。因此，虽然细胞系中的GFAP水平78% 成熟细胞而91% 未成熟细胞而降低，但在原代星形胶质细胞中观察到的GFAP表达的年龄相关增加得以维持。

4. 神经突生长支持随体外小鼠星形胶质细胞年龄的变化而减少

大鼠皮质星形胶质细胞显示出与年龄相关的神经突生长促进的衰减，其未成熟特性保持到培养的第10天 (Fawcett等，1989; Smith等，1990)。为了确定小鼠中这种变化的动力学，用雏鸡RGC培养在盖玻片上生长的原代皮质星形胶质细胞12小时，并测量来自滑片上每个RGC的最长至少18千米的神经突。Smith等人 (1990) 已经表明，雏鸡rgc和大鼠前脑神经元在大鼠星形胶质细胞上显示出等效的神经突生长。我们使用2个参数来评估神经元与星形胶质细胞的相互作用 :( 1) 每个盖玻片的神经突长度之和用作神经元附着/存活以及神经突起始和生长的累积量度，以及 (2) 平均神经突长度用于评估总生长支持的一个方面。

在培养2、6或大于25天的情况下测定新生小鼠皮质星形胶质细胞的神经突生长支持 (表111)。2天星形胶质细胞上的神经突长度的总和分别是6天或> 25天的星形胶质细胞的1.6和2倍。平均神经突长度遵循相同的进展，2天星形胶质细胞的平均长度为1.5，6天和> 25天星形胶质细胞的平均长度为2倍。因此，小鼠的成熟时间似乎比大鼠快。培养6天后，小鼠星形胶质细胞支持神经突生长的能力大大降低。

Fig. 4.(A)注射(i)未处理球体、(ii)TGF-β处理球体、(iii)未处理细胞和(iv)TGF-β处理细胞4周的小鼠的代表性全身荧光图像手术后。(B)显示了每组中荧光素酶信号的量化。(C)在原位肝癌小鼠模型中形成的宏观肿瘤。显示了注射有(i)TGF-β处理球体和(ii)未处理细胞的小鼠肝脏的代表性图像。还显示了在腹膜(iii，箭头)和隔膜(iv，圆圈中)中检测到的转移性结节的图像。(D)显示了每组(右图 )每个肝脏的平均肉眼结节数。(E)

5.永生化星形胶质细胞系上的神经突生长减少，但部分年龄相关差异明显

在3个实验中评估了鸡RGC神经突在永生化细胞系上的生长。为了控制神经元制剂的差异，还测定了体外老化34-47天的原代星形胶质细胞。老化的星形胶质细胞已经成熟到促进生长的平稳水平 (Frisa和Jacobberger，199 1)。NIH 3T3细胞被用作非星形胶质细胞对照。

与原代星形胶质细胞相比，永生化细胞系在神经突生长支持下减弱，但在未成熟和成熟细胞系的比较中可以看出年龄相关的差异 (表IV)。PO-2D细胞系的每个盖玻片的神经突长度总和是PO-17D细胞系的1.5倍。PO-6D系是中间的。PO-17D线上的神经突长度的总和约为老化的初级星形胶质细胞的一半，但比3T3成纤维细胞大2.25倍。

通过用TuJ 1免疫染色观察星形胶质细胞系上的神经突生长，TuJ 1特异性结合小鸡视网膜制剂中的rgc。这使我们能够研究参数的所有组成部分，即 “神经突长度之和”。每个盖玻片的rgc总数是神经元附着和存活的量度，在永生化组之间没有年龄依赖性差异 (表IV)。PO17D细胞系的RGC存活率14% 低于成熟的原代星形胶质细胞，但差别无统计学意义。

PO-17D品系显示与PO-2D品系相比引发神经突的rgc的百分比降低了22.5%，与成熟星形胶质细胞相比降低了26% (表IV)。然而，成熟品系的神经突起始比3T3细胞高1.6倍。因此，与凡人星形胶质细胞相比，在细胞系上的神经突起始减弱，但是新生儿和成熟细胞系之间的年龄相关差异很明显。

平均神经突长度也在细胞系上减弱，在这种情况下，未观察到统计学上显着的与之相关的差异 (表IV)。细胞系上的神经突长度是老化原代星形胶质细胞长度的80%，但是3T3细胞长度的1.25-1.3倍。

因此，在我们测试的所有SV40标签永生化小鼠星形胶质细胞系中，支持神经突生长的能力都减弱了。然而，细胞系支持神经突的生长明显优于非星形胶质细胞系，这表明维持了一定程度的星形胶质细胞特征，并且复合参数 “神经突长度总和” 与年龄相关的差异，其中包括神经元附着和存活，神经突起始和神经突延伸是显而易见的。所有年龄组的神经元附着存活都是相同的，未成熟细胞促进神经突延伸的增强能力并未保留，但是，保留但下调的功能是神经突启动。

“测试的细胞系数量或原代星形胶质细胞培养物数量。bGFAP表达通过流式细胞术如材料和方法中所述测量，并以任意荧光单位t SE报道。'新生星形胶质细胞培养2天 (未成熟) 或30天 (成熟)。培养16天的GFAP水平 (n = 2) 与30天的差异没有。* P = 0.000278用于比较2天和17天的系。** P = 9.77e-05用于比较未成熟和成熟细胞。

孵育12小时后，测量了接种在星形胶质细胞单层上的胚胎雏鸡视网膜神经节细胞的神经突生长图

孵育12小时后，测量了接种在星形胶质细胞单层上的胚胎雏鸡视网膜神经节细胞的神经突生长。将细胞固定在甲醛中，并用A2B5免疫染色。测量了每个神经节细胞中至少下午18点的最长神经突。每个盖玻片的这些长度和平均长度的总和被报告为SE。“测试的星形胶质细胞培养物的数量。* P = 0.0387用于比较2天和> 25天的星形胶质细胞。** P = 0.0318用于比较2天和> 25天的星形胶质细胞。P = 0.0129用于比较2天和> 25天的星形胶质细胞。

培养12小时后，测量了接种在星形胶质细胞单层上的胚胎雏鸡视网膜神经节细胞 (rgc) 的神经突生长图

培养12小时后，测量了接种在星形胶质细胞单层上的胚胎雏鸡视网膜神经节细胞 (rgc) 的神经突生长。将细胞固定在甲醇中并用tuj1免疫染色。同时测定成熟的原代星形胶质细胞作为对照。测量每个神经节细胞的最长至少18 )* m的神经突。报告了每个盖玻片的这些长度之和，每个盖玻片的rgc总数，带有神经突的rgc百分比以及平均神经突长度k SE。“测试的细胞系数量或3T3或星形胶质细胞培养物数量。* P = 0.0122用于2天和17天细胞系的比较。P = 0.00531用于比较17天细胞系和3T3细胞。P = 0.000219用于比较17天细胞系和成熟星形胶质细胞。** P = 0.069用于17天细胞系和成熟星形胶质细胞的比较。*** P = 0.0011用于2天和17天细胞系的比较。P = 0.0015用于比较17天细胞系和3T3细胞。P = 0.00018用于比较17天细胞系和成熟星形胶质细胞。**** P = 0.00162用于比较17天细胞系和3T3细胞。P = 9.71e-05，用于比较17天细胞系和成熟星形胶质细胞。

图3.永生化细胞系，原代星形胶质细胞和3T3细胞的生长促进。给出了永生化细胞线 (虚线) 上每个盖玻片的神经突长度 (填充符号) 和平均神经突长度 (开放符号) 的总和相对于初级星形胶质细胞 (实线) 和3T3细胞 (不均匀虚线) 的相同值。该数据取自表111和IV，其中细胞系和3T3细胞的值标准化为成熟的原代星形胶质细胞。

结论与讨论

逆转录病毒介导的SV40 T抗原基因的转移产生了不朽的小鼠皮质星形胶质细胞系，能够在培养物中形成稳定的单层。这些品系保留了1型星形胶质细胞的分化表型，通过形态学，GFAP表达以及支持神经突生长的能力比成纤维细胞对照细胞 (NIH 3T3) 更高。此外，当将培养早期永生的未成熟新生星形胶质细胞与培养数周后永生的衰老星形胶质细胞进行比较时，与年龄相关的表型的总体模式保留了细胞形态，大小，生长模式，GFAP表达和神经突起始。然而，与相应年龄的原代星形胶质细胞相比，GFAP表达和神经突生长支持减弱。

在初级星形胶质细胞培养过程中，一些形态变化很明显。未成熟的星形胶质细胞比成熟的星形胶质细胞更纺锤形，粘附在培养皿上的效果较差，细胞与细胞之间的接触更少，并且生长到更高的密度。未成熟的星形胶质细胞30% 小于成体细胞。这些与年龄相关的关系保留在未成熟和成熟阶段永生的星形胶质细胞中。

GFAP表达随着星形胶质细胞年龄的增长而增加 (Chiu和Goldman，1984; Frisa和Jacobberger，199 1)，并且预期在成熟星形胶质细胞的细胞系中比在未成熟细胞的细胞系中更高。从免疫印迹中可以明显看出，6天和17天系的GFAP水平通常高于2天系。流式细胞术证实，2天细胞系的GFAP含量少于17天细胞系，并且两组细胞系的表达均少于母体星形胶质细胞群体。因此，GFAP表达模式与永生化星形胶质细胞系中年龄相关差异的保留一致，但与不表达Tag的星形胶质细胞相比，表达明显受到抑制。

总神经突生长支持，或每个盖玻片的神经突长度之和，是一种复合统计量，涵盖了星形胶质细胞-神经元相互作用的许多方面。它反映了神经元附着，存活，神经突起始和神经突延伸的差异。增加这些组件中的任何一个都会增加总长度统计。对于神经突长度的总和，与每个年龄的原代星形胶质细胞相比，细胞系中的表型有相等的减少 (图3)。当解剖该表型的成分时，很明显，主要的成熟特异性作用是神经突起始的年龄依赖性降低。这表明Tag表达减少了总长度参数的起始和可能的其他组成部分，从而将与年龄相关的差异保留在减弱的水平。

神经突延伸 (平均神经突长度) 在PO-2D系中被强烈下调，但在PO-6D系和PO-17D系中被弱下调 (图3)。所有永生化年龄组均以接近成熟星形胶质细胞的水平支持神经突延伸。因此，SV40标签的表达或永生化抑制了新生儿特异性神经突的延伸支持，或者没有阻止正常成熟依赖性的表型降低。在任何一种情况下，由于细胞系比3T3细胞支持更多的神经突延伸，因此这些细胞系似乎保留了一定程度的星形胶质细胞特异性神经突延伸支持。这可能是由于星形胶质细胞的成年阶段特异性分子的表达所致。

关于大鼠星形胶质细胞系的最新结果 (Goodman等人，1993) 与我们对小鼠的结果相似，因为新生和成年星形胶质细胞之间的神经突起始差异得以保留。然而，与年龄相关的在大鼠系中，平均神经突长度的差异保持在减弱的水平，但在小鼠系中却消失了。成熟的大鼠星形胶质细胞系是由成年大鼠产生的，而不是由在体外短期内成熟的星形胶质细胞产生的。随着动物年龄的增长，神经突生长支持可能会逐渐减少。另一种解释是小鼠和大鼠对T抗原的反应不同 (Patschinsky et a]，1992)。

许多证据表明，星形胶质细胞上的神经突生长是涉及许多分子物种的复杂过程 (参见Reichardt等人，1989; Bixby和Harris，1991; Walsh和Doherty，1991综述)。我们在神经突生长支持中观察到的影响可能是由于Tag表达引起的，并且Tag可能与星形胶质细胞表型这一方面的多个成分相互作用不同。一个简单的模型是标签下调对神经突生长重要的新生儿特异性分子。对该模型的支持来自醌-Jenab等人 (1990) 的工作。他们报道了从用温度敏感标签永生化的新生儿培养隔离出小鼠下丘脑星形胶质细胞系。在允许的温度下，神经细胞粘附分子 (NCAM) 的表达水平较低。在转移到高燕鸥之后因此，NCAM的表达明显增加。这表明一个分子在新生儿星形胶质细胞上高水平表达，但不是成熟的星形胶质细胞 (Frisa和Jacobberger，1991; Smith等人，1993)，并与神经突生长有关 (Neugebauer等人，1988; Doherty等人，1990a，b，1991; Smith等人，1990) 被标签表达下调，但当标签不活动时重新表达。我们已经测量了多克隆标签永生化新生星形胶质细胞细胞系的NCAM水平 (未发表)。这些品系在培养2天时表达NCAM的水平低于新生儿原代星形胶质细胞水平的20%。NCAM下调可能是新生儿神经突延伸表型丧失的因素之一。HNK-1，随着星形胶质细胞年龄的增加而减少的细胞表面碳水化合物表位 (Frisa和Jacobberger，1991; Smith等，1993) 在永生化细胞系上也较低。由于该表位被许多蛋白质共享，因此这表明Tag可能在共同点起作用以影响这些分子的整体损失。我们的简单模型表明，成年星形胶质细胞上的神经突生长可能取决于不受Tag影响的分子。例如，我们已经表明，成熟时的N-钙粘蛋白表达高于新生星形胶质细胞 (Frisa和Jacobberger，1991)。该分子的表达在多克隆细胞系中似乎未下调 (未发表)。

为了产生对研究具有最大作用的永生化细胞系，有必要开发永生化载体，以产生表现出最小的表型改变的星形胶质细胞系。由于我们已经在定量方面定义了星形胶质细胞表型，因此这项工作为SV40标签的突变分析提供了基础，以测试一下我们标签诱导的下调的简单模型的有效性，如果成立，则确定负责表型衰减的域。与Tag相互作用的许多细胞分子是已知的，并且缺乏这些相互作用的Tag突变体很容易获得。因此，如果Tag特异性下调新生儿神经突生长表型，我们可能会发现一些调节分子，从而调节星形胶质细胞神经突生长支持表型的途径。

此外，我们期望这些细胞系是有用的 :( 1) 用于表达被认为在神经突生长支持中重要的分子，以努力重建神经突生长表型;(2) 在没有成熟的情况下对星形胶质细胞周期控制的调节进行初步研究 (因为它们仍然对生长因子有反应); (3) 为基因转移研究提供良好的非致瘤性克隆细胞，以检查特定癌基因在神经胶质瘤发展中的作用。总之，我们在逐渐进行55消耗臭氧层培养后，用SV40标签将新生小鼠星形胶质细胞永生化，并评估了所得克隆细胞系的成熟程度。这些细胞系显示出高度的接触抑制并被生长调节。细胞形态，生长模式，细胞大小，GFAP表达以及星形胶质细胞促进神经突生长的能力被用来定义从未成熟状态到成熟状态的转变，该转变对应于失去神经再生潜能的体内时期。在培养的第2天创建的新生儿系似乎在未成熟状态下被部分阻止，即，它们显示出比成熟状态更多的暗示未成熟状态的方面。在培养的第6天和第17天产生的细胞系在表型上与成熟的星形胶质细胞相似。在所有年龄组中，与凡人星形胶质细胞相比，表型的某些方面均下调。

总的来说，证据表明 :( 1) 永生化确实使星形胶质细胞停滞在特定的成熟阶段; (2) T抗原的表达或永生化导致星形胶质细胞特异性表型的广泛下调或减弱;(3) 增加新生儿特异性神经突延伸的神经突生长支持的成分似乎通过相同的机制被完全废除，或者因为表型的这一方面发展到成熟而与其他性状无关。