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实验技术指南

4T1细胞培养方法

时间：2023-01-12 17:45:45 点击：2404次

4T1细胞培养说明书下载

4T1细胞背景简介

4T1细胞是从410.4瘤株中未经诱变筛得的6-硫鸟嘌噙抗性细胞株。当4T1细胞注射到BALB/c小鼠中时，4T1细胞会自发产生高转移肿瘤，可转移到肺、肝、淋巴结和大脑，同时在注射部位形成始发灶，诱导转移时不需要摘除始发灶。4T1细胞在BALB/c小鼠中的生长与转移特性与人体中的乳腺癌十分相近，这种肿瘤是人Ⅵ期乳腺癌的动物模型。4T1细胞诱导的肿瘤在手术后及未手术情况下转移的动力学相近，可以用作手术后及未手术模型。4T1细胞诱导的肿瘤模型跟其他肿瘤模型相比，由于4T1细胞的抗6-硫鸟嘌噙特性，微小的转移细胞团（少到仅仅1个）也可以在许多远端器官中检测到，没必要数淋巴结或称重器官。

小鼠乳腺癌细胞4T1形态

ATCC细胞库4T1细胞图片

4T1细胞培养实验准备

提前开启紫外照射30min消毒灭菌，工作台开灯通风10min，用75%酒精擦拭台面。

器材耗材：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头（白色0-10ul；黄色20-200ul；蓝色100-1000ul）、滤器、吸管、多孔培养皿、6cm皿、10cm皿，培养瓶等。

试剂：DMEM培养液、缓冲液、PBS、消化液、血清、抗生素。

4T1细胞培养条件

形态特征：上皮细胞样，贴壁生长

培养基： 90%DMEM+10% FBS+PS

生长条件：气相：95%空气+5%二氧化碳；温度：37℃

传代方法：1:2至1:3，每周 3次

冻存条件：无血清冻存液（或者冷冻保存液：90%血清，10%DMSO，现用现配），液氮储存

4T1细胞培养注意事项

1.运输4T1细胞用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

2.收到4T1细胞后第一次传代建议1：2传代。注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

4T1细胞养操作步骤

4T1细胞复苏方法

1.将含有1 mL4T1细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀；

2.在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后轻轻吹匀；

3.将所有4T1细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL培养基，培养过夜）；

4.第三天换液并检查4T1细胞密度。

4T1细胞传代方法

如果4T1细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 -3min(视细胞消化情况而定)，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2-3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

3.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

4T1细胞冻存方法

待4T1细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例

1.收集4T1细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，然后进行细胞计数。

2.根据4T1细胞数量对应加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

4T1小鼠乳腺癌细胞培养常见问题

1.小鼠4T1细胞不长怎么处理？

这些因素都会影响细胞长得慢：a.没有保证密度，细胞长不起来；b.操作时力度没控制好，将细胞吹碎，状态变差；c.血清质量不好，影响细胞生长。

2.4t1细胞形态特征？

4T1细胞形态特征为上皮细胞样，贴壁生长。

3.4t1细胞用高糖DMEM吗？

是的，用高糖DMEM。

4.4T1细胞能成瘤吗？

Yes，forms tumors and metastasizes in BALB/c mice.

5.小鼠4T1细胞传代密度是多少？

4T1细胞建议在生长至80%汇合度时即应传代，以免细胞状态变差。

6.4T1细胞培养出现小黑点，怎么处理？

如果在显微镜下观察到了小黑点，基本上可以将范围缩小到是细菌污染或者细胞碎片这两种情况。

到底是污染还是碎片，可从以下几个方面进行判断：

1) 运动性

很多会动的小黑点，只是发生布朗运动的细胞碎片。在显微镜下观察黑点大小和形状是否规则，是否运动，是做布朗运动还是呈直线型快速移动。如果黑点大小不规则，做布朗运动，黑点可能是细胞碎片（可能是细胞状态不佳或者消化过度引起的），也可能是血清反复冻融产生的蛋白沉淀引起的，也可能是细胞的代谢产物。

处理方法：消化离心弃上清后，PBS重悬洗洗，750rpm低速离心4分钟，重新铺下，铺回去镜下观察一下是不是干净的

如果黑点大小一致，快速移动，很可能是细菌污染。

2）培养基的浑浊度

如果在显微镜下无法辨认，那就交给时间吧。细胞培养基对于细菌来说是非常营养的大餐。一旦发生污染，细菌就会大量繁殖。培养基PH值迅速下降，培养基变黄且会变浑浊。通常在12小时内就可以发现，而在48小时内就非常明显。