人外周血NK细胞分离、培养及鉴定教程

时间：2023-09-21 09:15:08 点击：405次

人外周血NK细胞分离、培养及鉴定教程

一：细胞简介

NK细胞又称自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞）是机体内重要的免疫细胞，NK细胞形态上属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓是除T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞约占血液中所有免疫细胞（白细胞数量）的15%属于天然免疫系统的核心细胞，NK细胞存在于大多数器官:骨髓、肺、淋巴结、外周血、脾脏和肝脏。NK细胞无须抗原预先致敏即可直接杀伤某些靶细胞，包括肿瘤细胞、病毒或细菌感染的细胞。

二：实验介绍

本实验室采用独有的细胞因子培养法，将外周血中的单个核细胞进行诱导经过14天的诱导培养CD3-/CD56+NK细胞绝对数量可扩增达到1000倍其纯度可达80%以上。

优势

1、无需预包被，操作简单

2、扩增效率高

3、目的细胞百分比高的特点

三：实验准备

仪器包括：离心机、显微镜、计数器、水浴锅、恒温培养箱、提前开启紫外线照射超净台30min,超净通风10min以上，水浴锅提前开启，加热至56℃。

提前准备好：移液管、T-75培养瓶、人外周血淋巴细胞分离液、清洗液、NK基础培养基、因子、1mL枪头、200μL枪头、移液枪、15mL离心管。

四：实验步骤

1、单个核细胞分离

血液样本为10mL取两支15mL离心管，各加入5mL分离液（与血液体积相同）用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液上面，500转、离心20min(分离PBMC时离心转速设置为慢升慢降，升为9，降调为0)离心后，此时离心管中由上至下分为四层第一层为血浆层,第二层为环状乳白色单个核细胞层,第三层为透明分离液层,第四层为红细胞层收集血浆到新的离心管中血浆56℃ 30min灭活900转离心10min 取上清，置于4℃保存用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一个50mL离心管中向所得离心管中加入10mL清洗液，混匀细胞300转，离心10min,弃上清，用吸管以10mL清洗液重悬所得细胞300转，离心10min之后重复进行清洗步骤弃上清后以 0.5mL 后续实验所需相应液体重悬细胞

2、NK细胞培养

D0天:约用10mL NK基础培养基，培养基加入因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自体血浆，将制备好的单个核细胞(PBMC)重悬按细胞密度1.0-2.0M ells/mL铺于T-75瓶中,摇晃混匀后，做好标记放入培养箱中进行培养。

D4天:补加10mL 培养基，(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自体血浆)此时瓶子含20mL培养基做好标记后，放入培养箱中进行培养。

D6天:补加20mL 培养基，(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自体血浆)此时瓶子含40mL培养基做好标记后，放入培养箱中进行培养。

D8天:往培养瓶补加40mL 培养基，(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和1%自体血浆)同时加入因子NK-E 将培养液转移至T-175瓶中此时瓶子含80mL培养基做好标记后，放入培养箱中进行培养。

D10天:往培养瓶补加80mL 培养基，(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E和1%自体血浆) 此时瓶子含160mL培养基做好标记后，放入培养箱中进行培养。

D12天:往培养瓶补加160mL 培养基，(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E和1%自体血浆) 此时瓶子含320mL培养基将培养液分至另一个培养瓶中做好标记后，放入培养箱中进行培养。

D14天到15天:收获目的细胞

注意事项

请勿吹打细胞，细胞维持抱团生长如果聚团过大，可轻操或者拍打培养袋,如果想得到更理想的扩增效果,可使用CD56抗体预包被瓶子。

五、细胞鉴定

流式鉴定细胞纯度达80%以上

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