小鼠皮层神经元细胞分离、培养及鉴定教程

时间：2023-11-06 10:16:23 点击：303次

小鼠皮层神经元细胞分离、培养及鉴定教程

一：细胞简介

皮层神经元细胞分离自脑皮层组织；皮层神经元细胞是构成中枢神经系统结构和功能的基本单位。神经元是具有长突触(轴突)的细胞，它由细胞体和细胞突起构成。在长的轴突上套有一层鞘，组成神经纤维，它的末端的细小分支叫做神经末梢。细胞体位于脑、脊髓和神经节中，细胞突起可延伸至全身各器官和组织中。细胞体是细胞含核的部分，其形状大小有很大差别，直径约4-120微米。核大而圆，位于细胞中央，染色质少，核仁明显。细胞质内有斑块状的核外染色质，还有许多神经元纤维。细胞突起是由细胞体延伸出来的细长部分，又可分为树突和轴突。每个神经元可以有一或多个树突，可以接受刺激并将兴奋传入细胞体。每个神经元只有一个轴突，可以把兴奋从胞体传送到另一个神经元或其他组织，如肌肉或腺体。皮质神经元是大脑皮质的主要组成细胞之一，是大脑进行功能活动调节的基本单位，参与动物多种中枢神经系统疾病的病理过程。通过形态学观察显示神经元从贴壁、伸出突起开始；突起逐渐增多，而后突起进一步增多并逐渐成网，同时细胞胞体增大，周边光晕明显。10-12d细胞最为丰满，随后神经元开始裂解，突起逐渐减少，细胞已退化变性，轮廓模糊，光晕消失，细胞变形。

二：实验工具

小鼠皮层神经元细胞贴壁培养基、小鼠皮层神经元细胞完全培养基、小鼠皮层神经元细胞基础培养基、小鼠皮层神经元细胞添加剂、皮层神经元细胞组织分离液、冰盘、HBSS缓冲液、胰酶、配好的dmem（500ml dmem+50ml 胎牛血清+5ml双抗）、尖头镊、弯镊、剪刀、10 cm培养皿、6 cm培养皿、70um细胞筛、台盼蓝、计数板

三：操作过程

提前开启紫外线照射超净台30 分钟。将培养基和添加剂室温融化，使用前室温中预温10-30 分钟。紫外照射完毕后，75%酒精消毒超净台，超净台通风10 分钟以上。包板：将10x的多聚赖氨酸（PLL）稀释成1x的工作液，每个六孔板加入2mL晃动，铺满底部。过夜，洗2-3次。（消化前的步骤在冰盘上操作）
1. 准备试剂：准备5个10 cm培养皿，5个6 cm培养皿置于冰上，倒入HBSS。
2. 取胎鼠：取E17.5天（14.5-17.5天大了会有胶质细胞）的孕鼠，处死后酒精消毒孕鼠，用手术剪剪开孕鼠腹部，将子宫取出，放入10 cm培养皿。
3. 洗子宫：将取出的子宫在剩余10 cm培养皿中洗3-4次，将胎鼠取出放入另一个10 cm培养皿。
4. 取脑子：用尖头镊剥离胎鼠头部及脑壳，取出脑子黑色画圈部分，放入6 cm培养皿。
5. 剥脑膜：将一个脑移至一个新的6 cm培养皿（两三个脑子用一个6 cm培养皿，防止太久HBSS升温），在解剖镜下去除嗅球（绿色的部分），小脑及两个大脑半球中间的连接物，将剥干净的皮层放入新的6 cm培养皿。
6. 消化：全部剥完后，吸走HBSS，用镊子夹碎脑袋，夹至浆糊状，每个脑子加入1ml皮层神经元细胞组织分离液，五个脑子一组，吹打均匀后，放入10 cm培养皿中，37℃消化12min（避免一个10 cm培养皿放入太多脑子，避免离心管消化，会导致消化不均匀）。
7. 终止消化：立即加入等量的配好的贴壁培养基终止消化，用5mL枪头吹打12下。
8. 过筛：将终止消化后的溶液，用细胞筛过滤。
9. 重悬：1000G离心5min，去除上清，以每个脑子加入1ml配好的贴壁培养基，重悬。
10. 计数：吹打均匀后，取10ul细胞稀释液，10ul 0.4%台盼蓝染色，混匀，计数。
11. 种板：每个六孔板，每孔1.0-1.2*10^6个，12孔板每孔5-6*10^5个，10 cm培养皿1.2-1.5*10^7
12. 换液：种板4小时左右换液，此时用配好的神经元专用培养基。
13. 培养：每3天换一次液。

四：细胞鉴定

1、形态观察

小鼠神经元细胞接种于细胞培养板中后，可见大而圆的神经元细胞，6 h 可观察到明显的细胞突起，随后可见粗大的轴突形成；40 h 左右神经元细胞轴突形成的网状结构逐渐密集，此时可见部分神经胶质细胞开始明显增多，应立即加入阿糖胞苷以抑制神经胶质细胞的分裂增殖，此后神经胶质细胞生长受到抑制。培养第 5 d时神经元细胞形态最为典型），其轴突和树突交织成稳定的网状结构。典型成熟的神经元具有大而清晰的核，主要特征为具有圆锥形长突起，轴突的直径全长均一，而树突的直径从胞体向末梢逐渐变细。

2、标志物鉴定

皮层神经元细胞经β-Tubulin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上。

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