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小鼠皮层神经元细胞分离、培养及鉴定教程

时间:2023-11-06 10:16:23 点击:234次

小鼠皮层神经元细胞分离、培养及鉴定教程

一:细胞简介

皮层神经元细胞分离自脑皮层组织;皮层神经元细胞是构成中枢神经系统结构和功能的基本单位。神经元是具有长突触(轴突)的细胞,它由细胞体和细胞突起构成。在长的轴突上套有一层鞘,组成神经纤维,它的末端的细小分支叫做神经末梢。细胞体位于脑、脊髓和神经节中,细胞突起可延伸至全身各器官和组织中。细胞体是细胞含核的部分,其形状大小有很大差别,直径约4-120微米。核大而圆,位于细胞中央,染色质少,核仁明显。细胞质内有斑块状的核外染色质,还有许多神经元纤维。细胞突起是由细胞体延伸出来的细长部分,又可分为树突和轴突。每个神经元可以有一或多个树突,可以接受刺激并将兴奋传入细胞体。每个神经元只有一个轴突,可以把兴奋从胞体传送到另一个神经元或其他组织,如肌肉或腺体。皮质神经元是大脑皮质的主要组成细胞之一,是大脑进行功能活动调节的基本单位,参与动物多种中枢神经系统疾病的病理过程。通过形态学观察显示神经元从贴壁、伸出突起开始;突起逐渐增多,而后突起进一步增多并逐渐成网,同时细胞胞体增大,周边光晕明显。10-12d细胞最为丰满,随后神经元开始裂解,突起逐渐减少,细胞已退化变性,轮廓模糊,光晕消失,细胞变形。

二:实验工具

小鼠皮层神经元细胞贴壁培养基、小鼠皮层神经元细胞完全培养基、小鼠皮层神经元细胞基础培养基、小鼠皮层神经元细胞添加剂、皮层神经元细胞组织分离液、冰盘、HBSS缓冲液、胰酶、配好的dmem(500ml dmem+50ml 胎牛血清+5ml双抗)、尖头镊、弯镊、剪刀、10 cm培养皿、6 cm培养皿、70um细胞筛、台盼蓝、计数板

三:操作过程

提前开启紫外线照射超净台30 分钟。将培养基和添加剂室温融化,使用前室温中预温10-30 分钟。紫外照射完毕后,75%酒精消毒超净台,超净台通风10 分钟以上。 包板:将10x的多聚赖氨酸(PLL)稀释成1x的工作液,每个六孔板加入2mL晃动,铺满底部。过夜,洗2-3次。 (消化前的步骤在冰盘上操作)
   1. 准备试剂:准备5个10 cm培养皿,5个6 cm培养皿置于冰上,倒入HBSS。
   2. 取胎鼠:取E17.5天(14.5-17.5天  大了会有胶质细胞)的孕鼠,处死后酒精消毒孕鼠,用手术剪剪开孕鼠腹部,将子宫取出,放入10 cm培养皿。
   3. 洗子宫:将取出的子宫在剩余10 cm培养皿中洗3-4次,将胎鼠取出放入另一个10 cm培养皿。
   4. 取脑子:用尖头镊剥离胎鼠头部及脑壳,取出脑子黑色画圈部分,放入6 cm培养皿。
   5. 剥脑膜:将一个脑移至一个新的6 cm培养皿(两三个脑子用一个6 cm培养皿,防止太久HBSS升温),在解剖镜下去除嗅球(绿色的部分),小脑及两个大脑半球中间的连接物,将剥干净的皮层放入新的6 cm培养皿。
   6. 消化:全部剥完后,吸走HBSS,用镊子夹碎脑袋,夹至浆糊状,每个脑子加入1ml皮层神经元细胞组织分离液,五个脑子一组,吹打均匀后,放入10 cm培养皿中,37℃消化12min(避免一个10 cm培养皿放入太多脑子,避免离心管消化,会导致消化不均匀)。
   7. 终止消化:立即加入等量的配好的贴壁培养基终止消化,用5mL枪头吹打12下。
   8. 过筛:将终止消化后的溶液,用细胞筛过滤。
   9. 重悬:1000G离心5min,去除上清,以每个脑子加入1ml配好的贴壁培养基,重悬。
   10. 计数:吹打均匀后,取10ul细胞稀释液,10ul 0.4%台盼蓝染色,混匀,计数。
   11. 种板:每个六孔板,每孔1.0-1.2*10^6个,12孔板每孔5-6*10^5个,10 cm培养皿1.2-1.5*10^7
   12. 换液:种板4小时左右换液,此时用配好的神经元专用培养基。
   13. 培养:每3天换一次液。

四:细胞鉴定

1、形态观察

小鼠神经元细胞接种 于细胞培养板中后,可见大而圆的神经元细胞,6 h 可观察到明显的细胞突起,随后可见粗大的轴突形 成;40 h 左右神经元细胞轴突形成的网状结构逐渐密集, 此时可见部分神经胶质细胞开始明显增多, 应立即加入阿糖胞苷以抑制神经胶质细胞的分裂增殖,此后神经胶质细胞生长受到抑制。培养第 5 d时神经元细胞形态最为典型),其轴突和树突交织成稳定的网状结构。 典型成熟的神经元具有大而清晰的核,主要特征为具有圆锥形长突起,轴突的直径全长均一,而树突的直径从胞体向末梢逐渐变细。

2、标志物鉴定

皮层神经元细胞经β-Tubulin免疫荧光鉴定,纯度可达90%以上。

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