人原代皮肤成纤维细胞分离、培养及鉴定教程

时间：2023-12-18 11:36:43 点击：659次

人原代皮肤成纤维细胞分离、培养及鉴定教程

一：细胞简介

人真皮成纤维细胞分离自皮肤组织内的真皮层，皮肤组织来源包括各个体表部位皮肤可依据需求选用。真皮，位于表皮深层，向下与皮下组织相连，真皮结缔组织的胶原纤维和弹性纤维互相交织在一起埋于基质内其由两层组成一乳头层与网状层真皮的结构组成是胶原蛋白、弹性纤维队及基质。

二：实验准备

PBS缓冲液、皮肤成纤维细胞专用培养基、皮肤成纤维细胞组织专用消化液1、皮肤成纤维细胞组织专用消化液2。

三：实验步骤

获取要求组织宽度大于3mm。在手术室中将组织置于预冷至4℃、含0.5%双抗的无菌PBS缓冲液中保证组织完全浸没，用含0.5%双抗的PBS缓冲液反复冲洗组织块10~15遍直至组织块表面无肉眼可见的污物再次用含0.5%双抗的PBS缓冲液冲洗处理后的组织块并用眼科剪剪成约5mm³的小块完全浸入HSF组织消化液1中将1.5 mL离心管用封口膜封口置于4℃冰箱中消化18~20h用明胶铺板十二孔板摇晃均匀放入培养箱中备用，次日，将1.5mL EP管取出，于超净台中打开用含0.5%双抗的PBS缓冲液冲洗使用显微镜将组织块撕下真皮层部分置于加入了HSF组织消化液2的培养血中，用眼科剪轻柔地将上皮尽量剪碎防止破坏培养皿底部导致污染，完全剪碎后，将培养皿盖好并用封口膜封住，置于细胞培养箱中，消化15min，每隔5min取出至超净台中反复吹打混匀。15min后，加入等体积的胎牛血清终止消化，将细胞悬液转移至50mL离心管中，在离心管上做好标记1000r/min,离心5min。吸去上清从培养箱中取出明胶铺板的十二孔板，吸弃孔内液体，用5mL人皮肤成纤维专用培养基重悬，转移至十二孔板中，在37℃、5%CO₂条件下培养。

细胞鉴定

接种后24h观察，可见很多长梭形的细胞从组织块周边迁出。也有部分多边形的上皮细胞迁出成团生长，另外可见少量折光强的圆形细胞。该细胞随换液和传代逐渐去除，一般5-6d后原代细胞铺满瓶底80%到90%时进行细胞传代，传代比例1:3传代后细胞形态较清楚，基本只见胞体细长呈长梭形和卵圆形居中的成纤维细胞，细胞长至汇合度达90%左右时细胞呈栅栏状、漩涡状、菜花状生长，5-6天后长至汇合度90%以上可连续传代20次以上，不同的细胞，由于具有不同的功能，分布着不同的蛋白质，上皮细胞具有特异的角蛋白，肌细胞具有特异的桥连蛋白，而成纤维细胞则包含有特异的波形蛋白，利用其特异标志蛋白，可以成功鉴定成纤维细胞。

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