小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞分离、培养及鉴定教程

时间：2024-05-06 10:04:21 点击：89次

小鼠脾脏CD3⁺T淋巴细胞分离、培养及鉴定教程

一：细胞介绍

T淋巴细胞是免疫系统主要的一类免疫细胞，表型特征为CD3⁺其主要亚型可以分为CD4⁺T和CD8⁺T,CD4⁺T细胞可以识别肿瘤细胞并大量分泌细胞因子，辅助CD8⁺T细胞、激活其他免疫细胞和刺激B淋巴细胞产生抗体所以也被称为辅助性T淋巴细胞，CD4⁺T-αβ细胞发育始于胸腺的淋巴祖细胞在胸腺细胞变成单阳性（SP）CD8⁺或CD4⁺胸腺细胞之前，淋巴祖细胞先后经历双阴性（DN）阶段和双阳性（DP）阶段，DP细胞通过与肽：MHC II类复合物的相互作用在胸腺皮质中进行阳性选择生成CD4⁺SP细胞，随后这些SP细胞从皮质迁移到髓质然后将在髓质中进行阴性克隆选择以去除与自身抗原高亲和力结合的T细胞最后，成熟单阳性CD4T-αβ细胞被释放到循环中。

二：实验准备

提前准备好将要用到的试剂：小鼠脾脏CD4⁺T细胞专用培养基、PBS清洗液、红细胞裂解液、分选buffer、Biotin-Antibody mix、Strsptavidin Beads。

三：实验步骤

制备单细胞悬液，从小鼠身上取出需要的脾脏器官在70 μm细胞筛网上研磨脾脏，以预冷的PBS冲洗细胞筛网收集细胞悬液于50 mL离心管中，放入离心机中进行离心，500g,离心5min。离心结束，弃上清，加入5 mL红细胞裂解液室温裂解5min,再加入20 mL PBS,500g,离心5min。注意红细胞裂解步骤可根据所用裂解液不同调整用量及时间，少量红细胞残留不会影响后续分选及细胞纯度，离心完成后，弃上清，将脾细胞重悬于PBS，细胞悬液用70 μm细胞筛网进行过滤提取细胞溶液进行计数，计数完成后，500g,离心5min离心完成后，弃上清将细胞重悬于分选buffer中

调整密度为1×10⁸cells/mL将100 μL细胞悬液加入无菌流式管底部再加入2 μL Biotin-Antibody Mix混匀后4℃孵育10min孵育完成后在流式管中加入20 μL Streptavidin beads轻轻吹打混匀，混匀后4℃孵育10min孵育完成后在流式管中加入1 mL分选buffer,用移液器上下混合吹打5次混匀（避免剧烈震荡或上下颠倒混匀），将含有细胞的分选流式管置于磁力架上静置5min将细胞悬液小心吸出，转移至一个无菌离心管中吸出过程注意不要碰到管壁磁珠此细胞悬液中即包含纯化的小鼠CD4⁺T细胞500g,离心5min，离心后弃上清，收集细胞将细胞接种于专用培养基中，转移至T25细胞培养瓶中十字摇晃混匀置于培养箱中进行培养。

细胞鉴定

流式鉴定分选前细胞纯度22.89%，分选后细胞纯度达96%以上