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第三课:条件性重编程的正常的和原代癌变的前列腺表皮细胞: 一个由病人细胞诱导的用于研究前列腺癌的全新细胞模型

时间:2021-12-01 09:27:41 点击:327次

研究背景

前列腺癌症是在美国男性中最常见的癌症。在2015年有2万多新确诊病例,其中有2千多病例死于前列腺癌症。相较于其他癌症细胞,体外培养前列腺癌细胞限制性很大,主要包括:第一,现有细胞系大多来自于转移的癌症,不能很好的重现前列腺癌细胞的特性;第二,病人肿瘤细胞移植模型,需要使用转移的癌症细胞,耗时长,成功率低。

借助于最近建立的2D的条件性重编程培养和3D的类器官培养技术,为建立体外的人的细胞模型提供助力。利用条件性重编程培养技术,有利于为建立特异性药物筛选系统。通过条件性重编程培养技术,作者通过结合条件性重编程培养技术和移植模型发现前列腺癌细胞来源于类前列腺基底细胞。通过这个条件性重编程技术有利于搭建细胞系平台研究肿瘤细胞的基因组水平和分子水平的改变。


结果与方法

一. 正常的和癌变的前列腺样本细胞培养的建立和鉴定

通过手术获取的病人的前列腺样品组织,进行体外重编程培养。并将非恶性组织细胞标记为GUMC-29 和恶性癌变的组织细胞标记为GUMC-30。将这两类组织细胞放在条件性重编程的条件性进行培养,并观察其形态学特征。GUMC-29和GUMC-30在形态学(图1A)和生长曲线上(图1B)并没有明显差异。将两株细胞放在琼脂上培养时,发现GUMC-30能够形成明显的细胞团结构(图1C)。当把GUMC-30细胞转移到免疫缺陷的小鼠体内时,GUMC-30细胞能够在小鼠体内形成肿瘤而GUMC-29细胞则不会(图1D,E)。因此,正常的组织细胞(GUMC-29)和癌变的肿瘤细胞(GUMC-30)能够在条件性重编程的条件下培养,并保持细胞原有的属性。


GUMC-29和GUMC-30在形态学(图1A)和生长曲线上(图1B)并没有明显差异


二. 利用荧光定量PCR和流式细胞鉴定前列腺表皮细胞的属性

作者利用qPCR和流式检测发现GUMC-29和GUMC-30表达的管腔细胞(luminal cell)的标志物和基底细胞(basal cell)的标志物没有明显差异(图2A)。当与其他的现有的前列腺肿瘤细胞相比,细胞标志物的表达有明显差异(图2B)。通过流式检测不同细胞类型的特异性标志物,发现体外条件性重编程培养的GUMC-29和GUMC-30都表达基底细胞的标志分子CD44和CD49f。并且有45%的细胞表达管腔细胞的标志分子CD13。

表达CD117的细胞被认为是前列腺干细胞。通过分析发现,GUMC-30中有5%的CD117阳性的细胞,而想对应的GUMC-29中 只有1%是CD117阳性的细胞。条件性重编程培养技术更像体外“瞬时扩增”细胞,所获得细胞在体外根据刺激不同可以分化成不同类型的细胞。

qPCR和流式检测发现GUMC-29和GUMC-30表达的管腔细胞(luminal cell)的标志物和基底细胞(basal cell)的标志物没有明显差异(图2A)

三. GUMC-29 和 GUMC-30样品的差异基因的表达情况

通过基因芯片分析,作者发现GUMC-29和GUMC-30之间有87个差异基因的表达,涉及细胞发育、生长、增殖和代谢(图3A)。并通过qPCR验证(图3B)。这些差异基因中,有部分基因可能会促进前列腺细胞的癌化,例如:CXCL11,NNMT。

GUMC-29和GUMC-30之间有87个差异基因的表达,涉及细胞发育、生长、增殖和代谢

四. 条件性重编程的肿瘤和移植生长的肿瘤的差异表达基因

因为GUMC-30能够在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤,所以作者推测,在GUMC-30形成肿瘤的过程中会伴随着细胞表面标志性分子的改变。为此,作者通过检测和比较移植GUMC-30细胞形成的肿瘤和条件性重编程培养的细胞的表面分子的差异,发现移植体内的GUMC-30形成的肿瘤细胞高表达管胞细胞的一些分子标记物,包括AR和NKX3.1。相对的,基底细胞分子的表面标志物显著下调(图4A)。同时,正常的GUMC-29细胞在类器官的培养下,也能够正常的分化产生雄激素受体(图4B)。因此,不管条件性重编程培养的肿瘤细胞和正常细胞,都具有分化的潜力。

AR和NKX3.1。相对的,基底细胞分子的表面标志物显著下调

五. 前列腺条件性重编程细胞的核型和外显子测序分析

对GUMC-29和GUMC-30进行了细胞和分子水平检测,发现GUMC-30细胞中有10%左右的细胞出现1额外多余的3号染色体(图5A)。并在GUMC-30细胞中发现有815种外显子的突变类型,并将其绘制成Circos(图5B)。

并在GUMC-30细胞中发现有815种外显子的突变类型,并将其绘制成Circos

六. 前列腺条件性重编程细胞SNPs、INDELs以及信号通路分析

根据现在的人类基因组序列信息GRCh37,将这些突变类型进行归类总结,并整理在表格里(图6A)。并将Garraway研究中的原代前列腺癌细胞测序结果和GUMC-30外显子测序结果共有基因进行聚类分析发现富集到在肿瘤信号信号通路集基因有11个(图6B)。

前列腺条件性重编程细胞SNPs、INDELs以及信号通路分析图

七. GUMC-30细胞测序和Garraway研究中测序结果重叠的基因

作者将Garraway研究中原代的前列腺癌细胞二代测序结果和本文中GUMC-30外显子测序结果进行比对分析,发现有133个共同基因。

GUMC-30细胞测序和Garraway研究中测序结果重叠的基因图

八. 肿瘤条件性重编程细胞的筛选

因为在临床取样的过程中,经常出现肿瘤细胞、正常组织细胞、基底细胞混合在一起的情况,所以作者想通过体外培养的方法将肿瘤细胞和其他细胞区分开来。作者将GUMC-29和GUMC-30分别在培养,然后转移至不含血清的DMEM培养基中培养三天,然后在转移至F培养基加Y-27632上培养五天,最后重现放到条件性重编程的条件下培养(图8A)。作者发现条件性重编程培养能够逆转“类成纤维细胞”或者“类间充质细胞”到上皮细胞的形态。为了验证这一猜想,作者将正常的原代包皮生成细胞和GFP标记的GUMC-30细胞1:1混合后放到DMEM中培养7天,发现只有GFP阳性的GUMC-30细胞能够成长。其中对照组,DMEM培养前以及一直在条件性重编程条件性培养的细胞GFP阳性只有50%左右(图8B和C)。

DMEM培养前以及一直在条件性重编程条件性培养的细胞GFP阳性只有50%左右图

总结与讨论

作者建立了同一病人中正常样品和癌变细胞的体外培养平台。并借此对进行核型、基因表达和外显子序列鉴定。


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