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hESC细胞培养教程第三节:hESC细胞冻存

时间:2023-03-06 17:39:20 点击:417次


本视频为厦门逸漠生物出品关于hESC细胞培养教程之:hESC细胞冻存,我们对每一步操作都做了演示,以便科研老师更好地理解hESC细胞冻存实验过程。

hESC细胞培养教程之:hESC细胞冻存

一.冻存条件

1.显微下观察细胞状态良好,细胞汇合度达85%左右可以收获冻存,一般6孔板可收集2-4x106个活细胞/孔,可冻存一管;

二.准备工作

1.准备相应数量的2 mL冻存管;标记细胞名称,代次,日期,操作人;

2.提前从4℃冰箱中取出Immocell hESC冻存液,置于室温预温,提前将梯度程序降温盒置于4℃冰箱中预冷;

三.hESC细胞冻存步骤

1. 从培养箱中取出待冻存细胞,吸弃皿中的hESC培养基,加入2 mL/孔的DPBS,再吸弃;加入2 mL/孔的Immocell EDTA传代工作液(0.5 mM), 使溶液完全覆盖孔底,将培养板置于细胞培养箱中;

2. 注意:保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触了,使其受热均匀,不要叠放,设定消化时间10 min;

3. 消化结束后,从培养箱中取出消化的细胞,显微镜下观察细胞变化,大部分细胞变亮变圆,且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化,若大部分细胞细胞仍未变亮,则需要延长消化时间;

4. 将消化好的细胞培养板拿回生物安全柜中,避免震荡摇晃细胞,倾斜吸弃Immocell EDTA传代工作液,摇匀预温的Immocell hESC冻存液,每孔加入1mL冻存液,轻柔吹打,水平十字摇匀3次,随后吸取细胞悬液加入1.5/2 mL冻存管中;

注意:Immocell hESC冻存液中的DMSO易沉积在溶液下部,如未摇匀可能造成开始用时DMSO浓度不够,后面用的DMSO浓度过高,造成冻存细胞的不稳定,将冻存细胞置于梯度程序降温盒中,置于-80℃过夜,次日转入液氮罐中长期保存,或使用程控降温设备将细胞降至-80℃以下后,直接转入液氮储存。

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