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hESC细胞培养教程第四节:hESC细胞传代

时间:2023-03-06 17:40:47 点击:450次


本视频为厦门逸漠生物出品关于hESC细胞培养教程之:hESC细胞传代,我们对每一步操作都做了演示,以便科研老师更好地理解hESC细胞传代实验过程。

hESC细胞培养教程之:hESC细胞传代

一.传代条件

细胞满足以下条件之一,即需要进行细胞传代:

1. 细胞汇合度达85%左右,移动视野观察细胞生长状态,整个皿密度均匀,没有过大的克隆或者克隆过于致密的部分,一般皿中心部分比边缘密度略大;一般情况下每4天传代一次,即使克隆团较小,汇合度不足,也建议不要连续培养超过5天;

2. 细胞汇合度较低,但干细胞集落过大,中央细胞生长不良;

二.传代间隔和比例

1. 可根据细胞生长状态和实验需求按1:5~1:20的比列进行传代;

2. 如果细胞正常,克隆汇合度85%, 大小均匀,建议按照1:10进行传代;

3. 如果密度偏低,则可降低传代比例,密度偏高,则增加传代比例。

三.准备工作

1. 提前30 min将Immocell hESC完全培养基,Immocell Y-27632(10 mM)和Corning Matrigel包被好的6孔板放置生物安全柜中,恢复至室温;

2.吸取4 mL hESC完全培养基加入到离心管中,按照1:4000比例加入1 μl的Immocell Y-27632(10 mM),充分混匀,恢复至室温;

四.hESC细胞传代步骤

1. 从培养箱中取出待传代细胞,吸弃孔内的hESC培养基,加入2 mL/孔的DPBS,轻轻摇晃并吸弃,再加入2 mL/孔的Immocell EDTA传代工作液(0.5 mM),使溶液完全覆盖孔底,将培养板置于细胞培养箱中;

注意:保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触了,使其受热均匀,不要叠放,设定消化时间10 min;

2. 吸弃6孔板中1孔的Matrigel包被液,加入预温的 Y-27632+hESC完全培养基2 mL/孔在6孔板上做好标记(细胞名称,代次,传代比例,日期和操作人);

3. 消化结束后,从培养箱中取出消化的细胞,显微镜下观察细胞的变化,大部分细胞变亮变圆,且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化,若大部分细胞细胞仍未变亮,则需要延长消化时间;

4. 将消化好的细胞培养板拿回生物安全柜中,避免震荡摇晃细胞,倾斜吸弃Immocell EDTA传代工作液,加入2 mL/孔预温的Y-27632+hESC完全培养基,水平十字摇晃6孔板使细胞脱离基质;

5.可轻柔吹打细胞1-2次;不能超过2次,避免将细胞吹打成单细胞状态,注意避免刮擦细胞,有部分细胞(10-15%)未脱离基质是正常,若有大量未脱离则需延长消化时间;

6.一次操作不要超过1个6孔板,当hESC培养基加入后要快速吸出。因为EDTA传代工作效果在hESC培养基加入后会很快被终止,在hESC培养基加入后细胞又会很快贴壁,而hESC培养基不能长时间处于EDTA传代工作液(<15min),所以收集接种细胞时操作必须快速。

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