小鼠胚胎成纤维细胞分离、培养及鉴定教程

时间：2024-02-26 09:23:38 点击：165次

小鼠胚胎成纤维细胞分离、培养及鉴定教程

一：细胞简介

小鼠胚胎成年维细胞常用作ES细胞培养常用的饲养层细胞，能产生抑制ES细胞自主分化和促进ES细胞增殖的因子，故能有效地促进ES细胞的增殖井维持其示分化特性和多潜能性，且分泌效果优于外源添加的一些因子而且可以为ES细胞的培养提供类似于体内的微环境故在研究哺彩L动物ES细胞中得到广泛使用。

二：实验准备

提前准备好将要用到的工具、试剂：无菌枪头、无菌EP管、小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基、胚胎成纤维细胞组织分离液、胚胎成纤维细胞基础培养基、HBSS缓冲液。

三：实验步骤

取孕13.5天小鼠,断颈处死，置于体积分数为75%酒精消毒3 min无菌打开孕鼠腹腔可见腹腔两侧呈“V”字型串珠样子宫。用镊子提起子宫（注意:不能碰到皮毛，以防污杂）并用眼科剪去除子宫系膜和结缔组织，将子宫放入含有HBSS的一次性无菌培养皿中漂洗两三遍去除淤血，用眼科剪和镊子去除胎盘、手膜等胚胎外组织，取出胚胎放入另一平皿用HBSS洗涤，直到没有血迹为止。用眼科剪和镊子去除胚胎的头部、四肢及内脏，留取躯干部（头部、四肢及内脏需去除干净）将躯干部放入玻璃平皿中用HBSS洗涤1次，用眼科剪将胚胎躯干部剪碎成糊状加入5mL HBSS混勿移入离心管中，自然沉降3min后将上清液轻轻吸出弃掉加入3mL 组织分离液轻轻吹打后室温下自然沉降2min，将上清液轻轻吸出弃掉加入3mL 组织分离液轻轻吹打后室温下消化3min，将上部的单细胞悬液轻轻吸出放入另一个离心管中加等量小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基终止消化，重复消化两次若还有未消化的组织再加入2 mL组织分离液轻轻吹打至完全消化。终止消化，混匀离心管收集所有细胞悬液自然沉降1min，将大块沉淀吸出弃掉800转每分钟离心5mi弃去上清，使用小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基重悬至5 mL吸取细胞溶液，加入台盼蓝进行计数按5x106/瓶接种到T25培养瓶中补足体积分数为小鼠胚胎成纤维细胞专用培养基记为原代（PO）摇晃混匀，在37℃、体积分数为5%二氧化碳的培养箱中培养，24h后换液。

细胞鉴定

24h后可见绝大部分贴壁细胞呈成纤维细胞样，细胞体积较小，杂细胞较少，30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起，6h后细胞基本贴壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀，散在生长，不聚集成团；分布较均匀，散在生长，不聚集成团，细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡，细胞融合，并彼此连接成网状，细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布，细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布，小鼠胚胎成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定纯度可达90%以上

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