大鼠软骨细胞原代分离、培养及鉴定教程

时间：2024-03-21 15:56:20 点击：128次

大鼠软骨细胞原代分离、培养及鉴定教程

一：实验原理

大鼠软骨细胞分离自软骨组织，软骨组织由软骨细胞、基质及纤维构成，软骨组织再生能力强这些增生的幼稚细胞形似纤维母细胞以后逐渐变为软骨母细胞，并形成软骨基质，细胞被埋在软骨陷窝内而变为静止的软骨细胞电镜下，软骨细胞有突起和褶皱，细胞质内有大量的粗面内质网和发达的高尔基复合体及少量的线粒体，在组织切片中，软骨细胞收缩为不规则形，在软骨囊和细胞之间出现较大的腔隙，体外培养的软骨细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。

二：实验准备

提前准备好将要用到的试剂：双抗溶液、软骨细胞组织专用消化液1、专用消化液2、PBS缓冲液、大鼠软骨细胞专用培养基

三：肋软骨分离

将大鼠用酒精喷洒消毒后置入超净台中，麻醉处死，加入PBS缓冲液进行冲洗，将皮肤从肚脐切开到胸骨，清除胸腔内的所有软组织剥离胸腔外的皮肤及软组织，用剪刀取下肋骨，放置于PBS中清洗，用镊子小心地将肋骨一根根取下细心刮取干净，用PBS冲洗两次将肋软骨片置于1 mL消化液1中在37℃培养箱消化45min加入10 mL组织消化液2用移液管搅拌组织碎片以分离软组织，提取软骨碎片之后放置在4℃培养箱中，过夜消化。

三：关节软骨分离

把5-6天的新生鼠消毒麻醉后放入超净台中处死，用剪刀和钳子去除后腿上的皮肤和软组织使股骨脱位并丢弃软组织，使用手术刀将股骨头、股骨髁和胫骨分离并放置在PBS中，关节软骨看起来像一个规则的半透明小球体，PBS冲洗两次将软骨组织里加入4 mL组织消化液1用剪刀修建成约1mm3的小块在37℃培养箱消化45min，加入消化液2，置于EP管中放置4℃冰箱，过夜消化，将细胞悬液通过4μm细胞筛放入15 mL的试管中，然后室温400g离心10min弃上清，并用5 mL PBS清洗放入离心机中400g离心10min然后用3 mL完全培养基重悬沉淀用细胞计数仪计数软骨细胞，提取细胞溶液到计数板上平均每只大鼠获得10⁶个软骨细胞，向培养皿中加入完全培养基，在培养皿上仪8*10^3/cm²个细胞的密度种板软骨细胞，摇晃混匀，在培养皿上做好标记，置于37℃，5%CO₂浓度的养箱中

细胞鉴定

一，形态观察:使用显微镜观察软骨细胞的形态，汇合的iMAC表现出典型的软骨细胞形态圆形或多边形，细胞质呈颗粒状。
二，标志物鉴定：检测iMACs京代培养中软骨细胞分化的主要标志物II型胶原蛋白聚糖的表达，体外培养6天后的合成富含II型胶原蛋白和蛋白多糖的基质，对II型胶原蛋白进行免疫荧光检测阿尔新蓝染色确定ECM存在蛋白多糖的基质（硫酸化蛋白聚糖）

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