间充质干细胞成骨分化实验教程

时间：2024-03-21 17:13:27 点击：189次

间充质干细胞成骨分化实验教程

一：实验原理

1. 在多种刺激因子和激素的刺激及其他特定的理化因素作用下间充质干细胞定向分化为骨原细胞。
2. 其后，骨原细胞进一步分化为成骨细胞前体细胞进入快速增殖期。
3. 细胞增殖能力逐渐下降细胞外基质成熟相关基因被进一步激活成骨细胞在此阶段合成和分泌有机基质形成类骨质，主要由1型胶原形成特征物是碱性磷酸酶是成骨细胞分化成熟的早期标志。
4. 成熟的成骨细胞表达ECM钙化相关蛋白主要是骨钙蛋白和骨桥蛋白成骨细胞矿化活力显著升高。

二：实验准备

提前准备好将要用到的试剂：细胞基础培养基、优级胎牛血清、明胶、茜红染液、间充质干细胞成骨诱导分化添加物。
提前六小时将优级胎牛血清放置于4℃冰箱内完全融化，提前30min将成骨诱导分化添加物放置于4℃冰箱内，将准备好的试剂移入超净台中上下颠倒或轻弹试剂管以混分试剂，先将优级胎牛血清加入细胞基础培养基中再将成骨诱导分化添加物也加入细胞基础培养基中取少量基础培养基，洗涤各瓶、管尽可能将所有成分全部加入基础培养基中拧紧基础培养基瓶盖轻柔并充分摇匀用封口膜密封瓶口用铝箔纸包裹瓶身再次用封口膜加固包装并标注名称、配制日期等信息。

三：诱导操作

加1mL 0.1%明胶到六孔板中摇晃均匀，使其能均分覆盖各孔底面将六孔板置于5%CO2浓度的培养箱中培养30min后吸去明胶即可用于接种细胞或等待六孔板晾千再接种将准备好的装有细胞的T75瓶从培养箱中取出显微镜下观测细胞状态转移至超净台中，吸去上清加入胰蛋白酶消化液至T75瓶中摇晃均匀置于培养箱中消化3min消化完成后加入含血清培养基将细胞吹打混匀加入离心管中进行离心准备1000转离心5min弃去上清，加入无血清培养基重悬吹打混匀提取一些细胞溶液加入台盼蓝进行染色计数往六孔板中加入每孔2 mL普通完全培养基按照2x10⁴cells/cm⁴的细胞密度接种于六孔板中之后置于培养箱中培养当细胞融合度达到70%时小心地将孔内完全培养基吸走,向六孔板中加入2mL间充质于细胞成骨诱导分化培养基将六孔板放入培养箱中进行培养每隔3天换用新鲜的间充质干细胞成骨诱导分化培养基,吸弃旧的培养基加入新鲜的成骨诱导分化培养基(注意:需待培养基回夏室温，缓慢滴加)诱导2~4周后视细胞的形态变化及生长情况准备用茜素红染色为防止成骨细胞脱落、钙结节损失建议成骨过程中出现明显钙结节之后每三天半量换液一次。

三：染色分析

成骨诱导分化结束后吸去六孔板中的成骨诱导分化完全培养基用PBS缓冲液轻系洗涤2~3次，吸弃孔内多余缓冲液每孔加入2mL的4%多聚甲醛溶液(或10%福尔马林)放入恒温室中，室温固定30min吸去固定液，加入PBS轻柔洗涤2-3次确保将固定液清洗彻底吸弃多余固定液每孔加入2mL茜素红染料工作液室温染色5~10min吸去茜素红染色液向里面加入PBS缓冲液，轻柔洗涤2~3次充分洗去染色液吸弃多余液体再次加入PBS缓冲液至六孔板中，将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果，染色后的六孔板用封口膜封装后置于4℃保存。
注意:1.为防止钙结节脱落，所有操作尽可能轻缓。
2.茜素红使用前请恢复至室温如果染色效果较差，可适当延长染色时间。
3.请确认出现钙结节后再进行染色。

细胞鉴定

短期的成骨分化可通过喊性磷酸酶来检测，长期的成骨分化则通过检测茜素红染色骨结节来鉴定具体检测以下三种物质。
1. 碱性磷酸酶，碱性磷酸酶经固蓝染色后在显微镜下呈现蓝色，未分化的细胞则无明显颜色。
2. “钙结节”长时间的成骨诱导会使钙离子以钙盐方式沉淀下来形成“骨结节”,骨结节可通过茜素红染色（茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色化合物）把外面沉积的钙结节染成深红色通过着色物面积和深浅来表示成骨分化的强弱。
3. MSC成骨分化后明显的成骨细胞特征性基因可使用RT-PCR对比不同实验组别的成骨分化差异。

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