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间充质干细胞成软骨分化实验教程

时间:2024-04-28 10:30:47 点击:141次

间充质干细胞成软骨分化实验教程

一:实验原理

MSC首先收回其突起,聚集成团这个团中间的细胞经分裂分化转变成一种大而圆的细胞即成软骨细胞成软骨细胞产生基质和纤维(主要为II型胶原蛋白),当基质的量增加到一定程度时成软骨细胞被分隔在陷窝内分化为成熟的软骨细胞,体外诱导成软骨分化的鉴定主要围绕成软骨的标志物II型胶原蛋白来进行

二:实验准备

提前准备好将要用到的试剂:细胞基础培养基、优级胎牛血清、阿利新蓝染色液、核固红染色液、间充质干细胞成软骨诱导分化添加物A、间充质干细胞成软骨诱导分化添加物B。
配置前6h将优级胎牛血清放置于4℃冰箱内完全融化,提前30min将成软骨诱导分化添加物AB都放置于4℃冰箱内将准备好的试剂移入超净台中上下颠倒或轻弹试剂管以混匀试剂,先将优级胎牛血清加入细胞基础培养基中再将成软骨诱导分化添加物也加入细胞培养基中取少量基础培养基,洗涤各瓶、管尽可能将所有成分全部加入基础培养基中,将培养基摇晃混合均匀用封口膜密封瓶口用铝箔纸包裹瓶身再次用封口膜加固包装并标注名称、配制日期等信息。

三:诱导操作

将准备好的装有细胞的T75瓶从培养箱中取出,显微镜下观测细胞状态转移至超净台,吸去上清加入胰蛋白酶消化液至T75瓶中,摇晃均匀置于培养箱中消化3min消化完成后加入含血清培养基,将细胞吹打混匀加入离心管中进行离心准备1000转离心5min弃去上清加入无血清培养基重悬吹打混匀,提取一些细胞溶液加入台盼蓝进行染色计数,往六孔板中加入每孔2 mL普通完全培养基将细胞按照2x104cells/cm4的细胞密度接种手六孔板中细胞置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养当细胞融合度达到70%时小心地将孔内完全培养基吸走向六孔板中加入2 mL间充质于细胞成软骨诱导分化培养基,将六孔板放入培养箱中进行培养,每隔3天换用新鲜的间充质干细胞成软骨诱导分化培养基首先吸弃旧的培养基,加入新鲜的成软骨诱导分化培养基
注意:需待培养基回复室温,缓慢滴加,诱导2~4周后视细胞的形态变化及生长情况用阿利辛蓝进行染色。

四:染色分析

吸弃孔内成软骨诱导分化完全培养基,用PBS缓冲液轻柔洗涤2~3次吸弃孔内多余缓冲液每孔加入2mL的4%多聚甲醛溶液(或10%福尔马林)固定10min以上,吸去固定液,加入PBS轻柔洗涤2~3次确保将固定液清洗彻底,吸弃多余固定液孔内加入1%阿利新蓝染色液(pH2.54)室温染色30min,吸阿利新蓝染色液,向里面加入PBS缓冲液,轻柔洗涤2~3次充分洗去染色液,吸弃多余液体加入0.1%核固红染色液室温染色5~10min,吸弃孔内染色液使用流水冲洗,吸弃多余液体家兔去离子水浸泡置于显微镜下观察染色效果。

细胞鉴定

软骨的破坏、缺失是包括骨关节炎在内的多种骨科疾病的重要病理改变,由于软骨特殊的解剖及组织特性如缺乏血和淋巴管的分布使得其自我修复能力异常不足,因此通过人工的方法修复软骨破坏具有重要临床意义,近年来随着间充质干细胞的发现和研究深入其来源广泛、良好的增殖能力、多分化潜能与各种3D支架材料具有良好的生物相容性等特性,使得其在软骨修复应用中具有令人期待的潜力。体外诱导软骨分化鉴定,主要围绕成软骨的标志物——II型胶原蛋白来进行,而甲苯胺蓝则主要检测成软骨细胞内酸性粘多糖。

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