| 一、细胞基本属性 |
| 细胞名称 | hiPSC人多能干细胞（STR鉴定正确） |
| 细胞别称 | hiPSC；人类诱导多能干细胞；人多能干细胞 |
| 种属来源 | 人/男性 |
| 组织年龄 | 内细胞团 |
| 生长特性 | 贴壁生长 |
| 细胞形态 | 球形克隆 |
| 背景简介 | hiPSC细胞株来源于ATCC，是将健康男性新生儿包皮细胞诱导成hiPSC，贴壁生长，呈克隆状，可在hESC/iPSC完全培养基中快速增殖，而边缘分化的细胞则在该培养基中生长较慢，从而选择性扩增并获得高纯度人多能干细胞。包装规格为1mL冻存管，含量为>1x106个/mL，且支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。 |
| 细胞荧光检测 | 
人多能干细胞hiPSC培养鉴定实验报告下载 |
| 细胞规格 | 1×106cells/T25培养瓶或者1mL冻存管包装 |
| 支原体检测 | 无 |
| 培养基 | hESC/iPSC细胞培养试剂盒（IMC-014） |
| 冻存条件 | 无血清冻存液，液氮储存 |
| 细胞货期 | 现货，1周左右 |
| 发货方式 | 复苏发货（免运输费用）/ 冻存发货（需加干冰运输费用） 顺丰快递 |
| 供应限制 | 仅限于科学研究，绝不可作为动物或人类疾病的治疗产品使用 |
| 特别说明 | 以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主 |
| 二、细胞培养操作 |
| 试剂准备 | 1）hESC/iPSC完全培养基配制（500 mL）
1.在4℃条件下解冻hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培养箱/水浴锅解冻。
2. 参考表1在生物安全柜中，使用无菌移液管混匀下列成分配制成hESC/iPSC完全培养基，之后置于4℃储存，封口膜封好后2周内使用。
3. 有初培养需扩建的需求，建议先配置100 mL,保证2周内使用完毕。 
2）Matrigel铺板（以货号为354277的Corning® Matrigel®包被6孔板为例）
A. 分装 Matrigel
1.货号354277的Matrigel，操作说明中不标注蛋白浓度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推荐Dilution Factor为278 μL，则表明278 μL可包被4块6孔板，分装数量=5 mL /0.278=17.98。
2. 准备18个无菌1.5 mL EP管，标记Matrigel日期、操作人；1mL无菌吸头；EP管架，均置于-20℃冰箱中预冷1小时。
3. 将Matrigel放置4℃冰箱过夜解冻，当Matrigel完全解冻即可开始分装。
注：在解冻时，将Matrigel放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。
4.准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。
5.混匀Matrigel，无菌分装于各个1.5 mL EP管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。
6. 将分装后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。
B.铺板
1.取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL离心管中，准备4个6孔板，标记Matrigel、批号、日期和操作人。
2.1 mL无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷1小时，取出一支冷冻的Matrigel（5mL）置于4℃冰箱解冻至完全化冻。
3.准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的Matrigel、预冷的1mL吸头放置于生物安全柜上。
4.用预冷吸头向解冻过的Matrigel（5mL）加入1 mL冷的DMEM/F12并反复吹打解冻混匀。
5.吸出已解冻混匀的Matrigel加入离心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反复吹打混匀。
6.分装1.5 mL/孔于4个六孔板中，轻轻摇晃混匀。
7. 培养板置于室温1小时后即可使用，或置于4℃冷藏过夜，两周内使用。 |
| 复苏方法 | 1）复苏hESC/iPSC（以6孔板为例）
1. 将水浴锅预热至37℃；并将Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（15~30℃）。
2. 取4 mL hESC/iPSC完全培养基，按照1:4000比例加入1 μL的hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（15~30℃）。
注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基。
3. 取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出。
4. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入10mL DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g离心5 min。
5. 吸弃上清，加入预温的4 mL的hESC/iPSC完全培养基+hESC/iPSC Supplement C制备细胞悬液，尽量避免吹打。
注：可留20 μL上清液，轻弹管底，使细胞悬浮液更均匀，避免成较大细胞团。
6. 吸除6孔板中2孔的Matrigel包被液，将细胞悬液按照2 mL/孔接种到1个孔中。
7. 水平十字摇匀三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。
8. 18-24小时后换新的hESC/iPSC完全培养基，之后每天更换培养基。
注：在hESC(H1)培养过程中，如果细胞的汇合度超过50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至3-4mL/孔。 
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| 传代方法 | 传代hESC/iPSC（以6孔板为例）
1. 传代条件：① 细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示），一般情况下每3-4天传代；
② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。
注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天。
2.传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀（如图1(C-D)所示），建议按照1:8进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例；密度偏高，则增加传代比例。
注：1:8传代就是1个孔瓶传8个孔（以6孔板为例）。
3. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（~25℃）。
4. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔的hESC/iPSC完全培养基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（~25℃）。
5. 将 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（~25℃）。
6. 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔的hESC/iPSC完全培养基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（~25℃）。
7. 将孔内培养基吸取，加入2 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃并吸取。
8. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆盖孔底。
9. 置于37℃培养箱中孵育8-9 min。
注：① 消化8-9 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；
② 保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。
10. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。
11. 及时加入2 mL/孔预温的hESC/iPSC完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字摇晃6孔板使细胞脱离基质。
注：① 加hESC/iPSC完全培养基 + hESC/iPSC Supplement C时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免反复吹打；有部分细胞（10%～15%）未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间（< 10min）。
②hESC(H1)细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接种细胞时操作必须快速,以及最好一次操作不要超过4孔（六孔板）。
12. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入预温的hESC/iPSC完全培养基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。
13. 在6孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤9获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。
注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤9获得的细胞悬液收集至2mL离心管，轻柔颠倒混匀细胞1-2次；再按照传代比例接种。
14. 接种后，水平十字摇匀6孔板三次，置于37℃，5% CO2浓度，饱和湿度的培养箱中， 再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。
15. 18-24小时后更换新hESC/iPSC完全培养基，此后每天换液，4-5天后继续传代/冻存。 |
| 注意事项 | 1.运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。 2.因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正常现象。
| 1.收货时若发现干冰化完，检查冻存管是否融化，若已融化需直接离心细胞接种观察，若未融化可以将细胞按正常步骤保存；
2.为保证细胞的高存活率，收到产品后，请立即解冻复苏细胞。 |
| 到货须知 | 1.收到细胞后，及时拍照记录有无漏液、浑浊或瓶身破损现象。
2.静置完成后，取出细胞培养瓶，镜检、拍照（当天以及第 2,3 天请拍照），记录细胞状态 (所拍照片将作为后续服务依据)；建议细胞传代培养后，定期拍照、记录细胞生长状态。 3.由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。
4. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。 |
| 备注：客户在细胞培养过程中，有任何技术问题可以拨打技术服务电话：400-080-3389 按 2，我们随时给予解答。 |
| 三、细胞冻存操作 |
| 冻存液配方 | 无血清冻存液，液氮储存 |
| 细胞密度 | 待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例 |
| 冻存方法 | 3）冻存hESC/iPSC（以6孔板为例）
1. 当细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示）可收获冻存，一般6孔板每孔可冻存1管。
2. 准备相应数量的1.5/2 mL冻存管，标记细胞名称、代次（P#）、日期、操作人。
3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室温预温，使用前注意摇匀。
4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃数次，再吸取。
5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，将细胞置于37℃培养箱中，计时8-9 min（可参考“六、传代hESC/iPSC”步骤）。
6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。
7. 摇匀预温的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL冻存液，轻柔吹打，水平十字摇匀3次，随后吸取细胞悬液加入1.5/2 mL冻存管中。
8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。 |
| 注意事项 | 冻存细胞转入液氮后及时复苏一管检查细胞冻存活性，若有异常，及时调整实验方案 |
| 四、售后服务 |
| 重发标准 | 1.细胞运输途中遭遇的各种问题，细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，重发； 2.收到细胞未开封，如出现污染状况，重发； 3.收到细胞3天内，发现污染问题，经核实后，重发； 4.常温发货的细胞静置 2 小时后，干冰冻存发货的细胞复苏 2 天后，绝大多数细胞未存活，经核实后，重发； 5.常温发货的细胞静置 22 小时并且未开封或干冰冻存发货的细胞复苏 2 天后，出现污染，经核实后，重发； 6.细胞活性问题，请在收到产品 3 天内给我们提出真实的实验结果，用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，经核实后，重发； 7.视具体情况而定。 |
| 不予重发 | 1.客户操作造成细胞污染，不重发； 2.客户严重操作失误致细胞状态不好，不重发； 3.非我们推荐细胞培养体系致的细胞状态不好，不重发； 4.细胞状态不好，未提供真实清晰的培养前 3 天的细胞状态照片，不重发； 5.细胞培养时经其它处理导致细胞出现问题的，不重发； 6.收到细胞发现问题与客服人员沟通的时间证明大于3天的，不重发； 7.视具体情况而定。 |
