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THP-1细胞培养指南及常见问题

时间:2022-12-08 11:55:49 点击:10837次

THP-1细胞培养说明书下载

THP-1细胞背景介绍

THP-1人单核细胞白血病细胞系是1980年Tsuchiya等人建立的人单核细胞白血病细胞系。它来自一位急性单核细胞白血病患者的血液,有分化为多种巨噬细胞的能力,是各领域研究常用的细胞系之一。

THP-1是人外周血的单核细胞系,最初来源于急性单核细胞性白血病患者。属于悬浮细胞,适合用于转染或感染实验。其表面抗原HLA型为:A2,A9,B5,DRw1,DRw2。

ATCC细胞库THP-1细胞图片

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逸漠细胞库THP-1细胞图片

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THP-1细胞的特点

1.THP-1细胞为悬浮生长,部分细胞聚集成团,部分细胞分散。

2.THP-1细胞喜欢酸性环境

在偏酸性环境中,THP-1生长更快,所以当培养基稍微变黄(呈橘红色)时,是适合细胞生长的,此时补液或半换液即可。

3.THP-1细胞有密度依赖性

THP-1细胞密度低时,生长较慢,培养密度维持在50万-100万细胞/毫升为宜;超过200万/毫升则需要传代。

4.THP-1细胞对血清要求高

血清质量差异可能引起细胞状态变化,建议选用高质量的胎牛血清。选择品质好的血清更有利于THP-1细胞生长。

THP-1细胞培养实验准备

提前开启紫外照射30min消毒灭菌,工作台开灯通风10min,用75%酒精擦拭台面。

器材耗材:玻璃瓶、培养瓶、培养皿、巴士管、离心管、移液枪、枪头、滤器、吸管、多孔培养皿、6cm皿、培养瓶等。

试剂:1640培养液、缓冲液、PBS、消化液、血清、抗生素、2-巯基乙醇。

THP-1细胞培养条件

THP-1细胞培养基:90% 1640+10% FBS+PS+ 0.05 mM 2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)

THP-1细胞传代比例:1:2至1:3,每周 2-3次

THP-1细胞代次密度:如果THP-1细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养

生长条件:气相:95%空气+5%二氧化碳;温度:37℃

冻存条件:无血清冻存液(或者冷冻保存液:90%血清,10%DMSO,现用现配),液氮储存

消化时间:1-3min(视细胞情况而定)

THP-1细胞培养注意事项

THP-1属于悬浮细胞,显微镜下可见细胞呈圆形,透明度高,背景干净,碎片很少,说明细胞状态很好。

2.THP-1常用RPMI 1640培养基,含10%胎牛血清,在37度、5% CO2培养箱中培养。特别注意的是THP-1喜欢酸性环境,对培养基pH值的变化很敏感,通常培养基颜色呈橘红色时细胞最适宜生长。所以尽量使用相同Ph的1640。

3.THP-1细胞有密度依赖性,低密度时细胞生长慢,建议细胞量维持在每毫升50-100万为宜,超过10^6/ml即可传代,传代比例采用1:3~1:4,换液不需要太频繁,正常2~3天换1次液即可。

注意细胞的密度一定要高,介于5×105—— 106/ML之间,增值的快。细胞数量太少,不适合THP-1生长,一般状态不好的THP-1在培养了3天后数量仍然不多,继续培养一天或者两天,培养基严重泛黄,细胞数会增加。这一点不同于同是单核细胞系的U937细胞。

4.传代后切忌常移出培养箱观察,否则会影响细胞生长,状态变差,一般首先表现为细胞内颗粒变多。一般THP-1 生长相当快,对于状态已经不好的情况,建议传代后3~4天再观察,一般4天时间培养基已明显泛黄,细胞数量巨增

5.THP-1细胞培养时需要添加0.05mM的β-巯基乙醇。

6.THP-1细胞培养时可能会有部分细胞聚团生长,若细胞团块过大过多,应当轻轻将其吹散。

THP-1细胞培养操作

THP-1细胞复苏方法

1.将含有1 mLTHP-1细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻;

2.THP-1细胞在1000 rpm条件下离心3 min,弃去上清液,加1 mL 10%FBS 1640培养基后吹匀;

3.将所有THP-1细胞悬液加入6 cm皿中,加入约4 mL培养基,培养过夜;

4.第二天检查THP-1细胞密度。

THP-1细胞传代步骤

如果THP-1细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

方法一

收集THP-1细胞,1000RPM条件下离心3-5min分钟,弃去上清液

补加1-2ml培养液后吹匀,将THP-1细胞悬液按1:2的比例分到新的含10ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二

可选择半数换液方式,弃去半数培养基后,将剩余细胞悬起

将THP-1细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

备注:第一次传代时,若培养基中有细胞碎片,则将细胞悬液装入无菌离心管中,1000 rpm离心4 min,弃去上清液,补加1-2 mL培养液后吹匀,按1:1分到新的装有10mL新鲜培养基的培养皿中,置于培养箱中培养。

THP-1细胞冻存步骤

待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面10cm皿为例;

1.收集THP-1细胞及细胞培养液,装入无菌离心管中,1000 rpm条件下离心4 min,弃去上清液,加 1 mL新鲜培养基重悬细胞,进行细胞计数。

2.根据THP-1细胞数量加入无血清细胞冻存液,使细胞密度5×106~1×107/mL,轻轻混匀,每支冻存管冻存1mL细胞悬液,注意冻存管做好标识。

3.将冻存管放入-80℃冰箱,24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

THP-1细胞培养常见问题及解决方法

1.THP-1细胞冻存过后复苏困难怎么办?

a.冻存前细胞状态较好, 冻存总量不低于1*106/支

b.复苏后细胞接种密度建议3*106/ml

c.如有细胞碎片,待细胞密度增大后通过低速离心去除

2.THP-1细胞收货时出现伪足,或是碎片较多怎么办?

受到运输影响,悬浮细胞会短暂性出现形态改变的现象,如伪足等。通过传代培养,1周左右可以恢复正常。一些THP-1细胞在运输途中死亡而产生碎片,通过传代离心可以去除。

处理方法

收集THP-1细胞,1000RPM条件下离心3-5min分钟,弃去上清液,补加1-2ml培养液后吹匀,将细胞悬液重新分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中,置于培养箱中培养。

3.THP-1细胞培养过程中细胞发生贴壁怎么处理?

THP-1细胞培养过程中出现少量细胞贴壁属于正常情况,不需要担心。可以轻吹收集细胞或者丢弃贴壁部分细胞。

处理方法

只需将THP-1细胞悬液转移至新瓶中即可。但如果当贴壁细胞的比例高于20%,说明细胞生长环境有异常,这时候就需要排查培养箱设置、培养基成分,以及培养器皿是否异常。

4.THP-1细胞培养过程中细胞发生聚团怎么办?

THP-1细胞培养过程中出现少量细胞聚团,呈葡萄串状,属于正常现象,特别是THP-1细胞密度较低时,易出现这种情况。

处理方法

可以更换血清品牌或增大血清比例(不超过20%)有助于解决聚团问题。不建议将聚团的细胞吹散,等待密度高时,会自己分散开。

5.THP-1细胞培养基里一定要加β-巯基乙醇吗?

β-巯基乙醇是一种常用的培养补充剂,有抗氧化的作用,可减少氧化应激对THP-1细胞的影响。当细胞密度过大但需要维持时,可适当增加巯基乙醇的比例(不超过标准量的1.5倍)。

6.THP-1细胞镜下观察时,难以聚焦或估算密度怎么办?

THP-1细胞形态特征悬浮生长,悬浮细胞会随着液体流动,不容易聚焦,静置5-10分钟使细胞沉底,之后再轻轻放上显微镜观察,将有助于聚焦和估算细胞密度。

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