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293细胞的大规模培养

时间:2022-11-15 10:15:56 点击:581次

293细胞是腺病毒载体的包装细胞。腺病毒是继逆转录病毒后用于基因治疗研究的热门载体。直接将腺病毒载体导入人体内表达目的基因,治疗恶性肿瘤、心血管疾病或一些遗传疾病已取得可喜进展;利用腺病毒载体在包装细胞293中表达分泌性蛋白质,如蛋白酪氨酸激酶1C等亦成为生产重组蛋白的一条途径。因此完善293细胞的大规模培养技术具有越来越重要的市场意义。哺乳细胞的大规模培养方式有三种:贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。

293细胞的大规模培养

293细胞特性

293 细胞是用5型腺病毒75株系转化,含有Ad5 E1区的人胚肾细胞。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与J.S.Miley于1976年用DNA转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型成上皮样细胞,表现出典型的腺病毒转化细胞的表型,细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。293细胞为人亚三倍体细胞系。293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长,也可生长在血清浓度降低的培养基中。

转瓶培养

转瓶培养一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段,或作为生物反应器接种细胞准备的一条途径。与传统静止单层培养相比,转瓶具有三大优点:为细胞提供较大的生长表面;轻微的转动可以防止培养液中形成的某些成分对细胞生长可能产生的影响;细胞大部分时间仅覆盖一薄层培养液,有利于气体交换。我们已成功实现293细胞的转瓶培养。由于293细胞对生长环境的改变较为敏感,细胞容易成团,因此维持稳定的温度、酸碱度和转动速度对细胞正常均匀生长至关重要。

现在使用的转瓶培养系统包括二氧化碳培养箱和转瓶机两部分。293细胞接种后,维持适当的转速培养。不同的细胞转速略有不同。细胞的均匀分散贴壁情况与培养液温度、瓶子的转动速度和细胞特性有关。在5-6天的培养周期中,细胞量可增殖20倍。

反应器贴壁培养

此种培养方式中,细胞贴附于固定的表面生长,不因为搅拌而跟随培养液一起流动,因此比较容易更换培养液,不需要特殊的分离细胞和培养液的设备,可以采用灌流培养获得高细胞密度,能有效地获得一种产品;但扩大规模较难,不能直接监控细胞的生长情况,故多用于制备用量较小、价值高的生物药品。

CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器是常用的贴壁培养式生物反应器,用于细胞的贴壁培养时可使用篮式搅拌系统和圆盘状载体。此载体是直径6毫米的无纺聚酯纤维圆片,具有很高的表面积与体积比(1200cm2/g),有利于获得高细胞密度。篮式搅拌系统和载体培养是目前贴壁细胞培养使用最多的方式,除用于293细胞的培养外,还用于杂交瘤细胞培养、Hela细胞培养、CHO细胞培养及其它细胞培养。此种方式培养293细胞,细胞接种后贴壁快,接种1小时后细胞贴壁率可达98%以上,采用灌流培养。整个培养周期约7-10天,细胞增殖 25-50倍。

微载体培养

微载体是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术,其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点,放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞,生产蛋白质产品,如293细胞、成肌细胞、Vero 细胞、CHO细胞。常用商品化微载体有三种:Cytodex1、2、3,Cytopore和Cytoline。

使用较多的反应器有两种:贝朗公司的BIOSTATB反应器,使用双桨叶无气泡通气搅拌系统;NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器,使用Cell-lift双筛网搅拌系统。两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。

微载体培养293细胞,首先要选择合适的微载体类型和搅拌速度。接种细胞可用1L spinner微载体培养系统或是其它贴壁培养方式准备,采用灌流培养,培养周期10-15天,能达到的细胞密度为5-10×106/ml。

无血清悬浮培养

无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式,它能减少后期纯化工作,提高产品质量,正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方向。要实现293细胞无血清悬浮培养必须先将贴壁培养 293改造为悬浮培养293S细胞并寻找适合高密度无血清培养的培养液配方。

悬浮培养时,由于缺少血清和蛋白的保护作用,293S对剪切力的敏感度增加,难以达到高密度培养,导致293S产生病毒的数量比贴壁培养低5-10倍左右。细胞接种后,灌流培养7天,达到细胞密度5×106/ml,增殖5-10倍。

结论

不管是哪种培养方式,首要的一点是必须操作规范、防止污染;其次根据需要选择合适的293细胞培养方式,对细胞生长状况实行有效的监控,以便获得稳定的蛋白或病毒产物。

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