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实验技术指南

通过 Cas9 快速鉴定基因组编辑的间充质干细胞单克隆

时间：2022-08-21 09:10:20 点击：628次

写在前面

今天推荐的文章是由深圳大学医学部基础医学院解剖学、组织学与发育生物学系，深圳大学医学院免疫学系，中国深圳市宝安市人民医院产科以及中国深圳福田市妇幼保健院产科发表在BIOTECHNIQUES2019年IF: C1.659，JCRQ3)，通讯作者是Zhong Huang 和Jianyong Xu教授

文章摘要

间充质干细胞 (MSCs) 已被深入研究并广泛应用于再生医学和免疫调节。然而，它们的功效在衰老或疾病过程中会下降。因此，具有特定基因过表达或抑制的基因组编辑的 MSC 在其治疗应用方面具有很大的前景。在这里，我们优化了直接 PCR 方法，用于快速识别只有 10 个细胞的基因组编辑的 MSC，从而减少了扩展 MSC 单克隆所需的时间和劳动力。结合我们之前针对 Cas9 优化的引导 RNA 结构和质粒构建策略，我们成功鉴定了 AAVS1 基因座中过表达 IL-10 的 MSC 单克隆。

研究背景

间充质干细胞(MSCs)具有多能(软骨细胞成骨细胞和脂肪细胞)和自我更新能力它们已被提出作为干细胞治疗的有效和安全的细胞来源，免疫原性低且没有重大伦理问题。在衰老或疾病过程中疗效下降。因此，具有特定基因过表达或抑制的基因组编辑的MSCs在治疗应用方面具有很大的前景。

通常，在基因组编辑后，需要扩增单个细胞单克隆以达到足够的细胞数量进行 DNA 提取，这既费时又费力。因此，开发和优化直接细胞裂解和 PCR 方法对于快速具有低细胞数的基因组编辑的 MSC 单克隆的表征。事实上，直接细胞裂解和 PCR 方法已广泛应用于许多领域，用于快速 DNA 表征。然而，其在表征基因组编辑的 MSCs 中的应用尚未得到证实。

在目前的研究中，我们首先比较了直接细胞裂解和 PCR 分析的不同方法。我们发现含有 Tween 20 和蛋白酶 K(PK) 的裂解缓冲液是从仅 10 个细胞中释放 DNA 的最有效方法，其灵敏度足以用于 PCR 检测此前，我们已经确定了一种优化的具有更高基因组编辑效率的引导 RNA 结构，并建立了一种更有效的 Cas9-gRNA 质粒构建策略，然后我们将这些技术结合在一起，将免疫抑制基因 iL-10 插入到 AAVS1 位点安全人类基因组的安全港。

方法与技术

材料与方法细胞培养

从脐带中分离出人MSC。出生后10分钟收集脐带并获得知情同意。脐带储存在DMEM/高糖(Gibco.USA)中，含抗生素(500units/ml青霉素和500ug/ml链霉素)冰上并送至实验室。细胞分离应在 8 小时内进行。将脐带切碎成 1-3 mm3 的碎片，并在 1 mg/ml 胶原酶 B(STEMCELL Technologies，在 DMEM/高葡萄糖中稀释)中在 37°C 下孵育 12 小时。然后将分离的单细胞在 DMEM/高葡萄糖(Gibco，USA)加 5% 血小板溶酶酸盐(Sigma)2U/ml 肝素和抗生素(100 units/ml 青霉素和 100ug/ml 链霉素)中扩增。用 0.05% 胰蛋白酶 EDTA(Thermo Scientific)传代人体 MSC。用流式细胞仪进行表征(CD90 FITC mouse anti-human BD Biosciences 555595 CD73-FITCmouse anti-human BD Biosciences 561254 CD105-FITC mouse anti-human BD Biosciences561443: HLADR-PE mouse anti-human BD Biosciences 562304; CD45-PE mouse anti-human BD Biosciences 555483:CD34-PEmouse anti-humanBD Biosciences 550761 CD19-PE mouse anti-human BD Biosciences555413:CD11b-PEmouse anti-human BD Biosciences555388使用Stem Prochondro genesis分化试剂盒(Gibco) StemPro进行分化脂肪生成分化试剂盒 (Gibco) 和 StemPro 成骨分化试剂盒 (Gibco)。

直接细胞裂解和PCR 比较了12种不同的直接细胞裂解方法。程序如下

(1) 直接裂解法：将细胞悬浮于15 ul PBS中，95℃孵育15 min，12.000rpm离心1 min后，上清液直接用于PCR。

(1l) PK 法：该方法如前所述进行，并进行了修改。简单地将细胞悬浮在 15 ul 裂解缓冲液(10 mM Tris-HCl，pH8.0，2mM EDTA , pH8.0，0.2M NaCl 和 1mg/ml 蛋白酶 K)中，然后加入 55 ℃ 60 分钟，然后 95 分钟 15 分钟，上清液在 12.000 rpm 离心 1 分钟后直接用于 PCR

(111) PK-T20(蛋白酶 K-Tween 20 法：该方法如前所述进行，并进行了修改。简言之，将细胞悬浮在 15ul lysis 缓冲液(10 mM Tris-HCl pH8.0,，2mM EDTA pH 8.0，2% Tween 20 和 1 mq/ml 蛋白酶 K)，然后 55*C 60 分钟，然后 95*C 15 分钟：上清液在 12,000 rpm 离心 1 分钟后直接用于 PCR。

(IV)PK-SDS-1(Proteinase K-SDS1%) 法：此方法如前所述进行，但有修改6] 简而言之，将细胞悬浮在 15 ul 裂解缓冲液中(1%SDS+1mg/mPK5% Tween 20.5%NP -40.0.1%BSA 和 1%PVP40)，然后是 55C 60 分钟，然后是 95C15 分钟;上清液以 12000 rpm 离心 1 min 后直接用于 PCR。

(V) PK-SDS-0.5(ProteinaseK-SDS 0.5%)法：细胞悬浮于15u裂解缓冲液(0.5%SDS+1mg/mlPK.5% Tween20.5%NP-40.0.1%BSA和1%PVP40)，然后55C 60分钟，然后95C 15分钟，上清液在12.000rpm离心1分钟后直接用于PCR

(VI)PK-SDS-01(蛋白酶K-SDS 0.1%)法：将细胞悬浮于15μlsis缓冲液(0.1%SDS+1ma/mlPK5%Tween20.5%NP-40.0.1%BSA和1% PVP 40)中，55°C 60 min，95°C 15 min，取上清液12000rpm离心1min后直接用于PCR

(VI) NaOH 法：该方法如前所述进行，但经过改良 10.151 将细胞悬浮在 10 u50mM NaOH 中，然后 95C 10 min，用 5ul(1/10 volume)1M Tris-HCl pH 8.0 中和;上清液在 12.000rpm 离心 1min 后直接用于 PCR

(VIII) KOH 法：该方法如前所述进行修改简单地将细胞悬浮在 10 ullysis 缓冲液(200mM KOH，50mMDTT)中，然后在 65C 下孵育 10 分钟，并通过 5 中和缓冲液中和(300mM KCl，900mM Tris-HC DH 8.3200 mM HCl：上清液用于 PCR 直接在 12 分钟后离心 1 分钟。

(IX)NL(N-Lauroysarcosinesalt)法：该方法按照之前的描述进行，并进行了修改[13]简而言之，将细胞悬浮在 15 ul 裂解缓冲液(3uH.O 3u/250na/ulpolvadenvlic acid3w10mM EDTA3w/250mMDTT 3u)中0.5%N-月桂酰肌氨酸盐溶液)，然后在 95℃ 孵育 10 分钟，上清液在 12000 转/分离心 1 分钟后直接用于 PCR

(X)NaOH-T20(NaOH-Tween20)法：细胞悬浮10溶解(100mM NaOH和2%Tween20)：95℃孵育10分钟，用5个中和缓冲液中和(100mM Tris-HCL2mM EDTA：12.000离心后上清直接用于PCR rpm 1 分钟

(XI)PK-Igepal-T20(Proteinase K-gepal Tween 20) 法：该方法如前所述进行，经过修改 8l。简单地将细胞悬浮在 15 ul lvsis 缓冲液(10 mM Tris-HC pH8.0，2 mM EDTA pH 8.0.1% Tween 20.1% lqepal 和 1 mg/ml 蛋白酶 K)，然后 55°C 60 分钟，然后 95°C 15 分钟，上清液在 12.000rom 离心 1 分钟后直接用于 PCR

(XIl)Amp(Extract-N-AmDBlood PCR Kits)法：细胞按照制造商的说明进行裂解(Sigma)

PCR在含有2x PCR Master Mix(Thermo Scientific) 10 uM正向和反向引物的25 u的totayolume中进行，以及从上述方法获得的12 ulcell裂解液。引物用于从 AASV1 位点扩增一个 1106 bp 片段。进行正向 5-CCCAACCCCATGCCGTCTTCACTCG-3 和反向：5CTAGGACCACCATTCTCA CAAAGG-3,40次PCR 循环

基因鉴定

供体质粒购自 SBI System Biosciences)。按照制造商的说明，将人 IL-10 进行 PCR 扩增并克隆到供体质粒中，如前所述将 gRNA 靶序列 (5-GGGGC CACTAGGACAGGAT-3) 克隆到我们的 Cas9-gRNA 系统中, 通过 PureYield™ Plasmid Maxiprep System (Promega) 纯化质粒。 1 µg 供体质粒，加上 500 ng gRNA 质粒和 500 ng hCas9 质粒与 2 µl Lipofactamine 3000(Thermo Scientific)混合，在 p6 板中转染 20 × 104 人 MSCs/孔。 48 小时后，用 MSC 培养基中和后，将细胞用胰蛋白酶消化并在 p96 板中稀释成每孔 0.5 个细胞。 2周后，根据制造商的说明(SBI，System Biosciences)，用优化的方法直接裂解细胞并进行PCR表征。通过人 IL-10 Quantikine ELISA 试剂盒(D1000B，R&D Systems)验证 IL-10 蛋白分泌。

Real-time PCR

如前所述进行 RNA 提取和实时 PCR。用于扩增 IL-10 的引物是：

正向 5'-GCC TAA CAT GCT TCG AGA TC-3';

反向 5'-TGA TGT CTG GGT CTT GGT

TC-3' ; IL-37：

正向 5'-TCA GCT GAA GAA GGA GAA ACT G-3';

反向 5'-TTA TCT GTC ACC CCA ACA GG-3'

研究内容

为了确定基因组编辑的 MSCs 直接细胞裂解和 PCR 表征的最有效方法，使用野生型 MSCs 比较了总共 12 种不同的方法，包括以前证明的方法和一些修改的方法。首先将 MSCs 接种到 96 板上，每孔有 1、10、102 和 103 个细胞。过夜孵育后，用指定的细胞裂解方法直接裂解细胞。一个通过 PCR 扩增的 1106 bp DNA 片段用于评估从不同数量的 MSC 释放 DNA 的效率。使用 2 x PCR mix (Thermo Scientific) 进行 PCR，含或不含 0.1% BSA 和 1% PVP40，这可以提高 PCR 效率并释放聚合酶抑制作用。数据显示，方法 III (PK-T20) 和 XI (PK-Igepal-T20) 是最有效的方法，仅从 10 个细胞中成功扩增了目标 DNA 片段(图 1)。此外，DNA 片段可以从 10 到 103 个细胞成功扩增，使其适用于低细胞数和高细胞数(图 1)，因为增殖能力可能因不同的 MSC 克隆而异。但是，添加 BSA 和 PVP40 并没有提高效率。

方法III(PK-T20)通过Cas9将IL-10正确插入AASV1位点来表征MSC单克隆，IL-10是一种具有免疫抑制功能的重要抗炎因子。尽管MSCs已被广泛研究用于治疗自身免疫性系统性红斑狼疮等疾病，它们的治疗功效应通过免疫抑制因子 IL-10 的过表达来增强。因此我们试图将 IL-10 引入人类基因组安全港 AASV1 位点。gRNA 结构和Cas9系统之前已被证明(图2A)供体结构和靶序列从SB(图2A)获得数据表明方法IIl(PK-T20)可以成功识别左臂PCR特征的集落(图2B) .并通过右臂PCR(图2C)进一步证实了这一点。然后通过实时PCR在没有供体插入的菌落16(C16)和正确插入的野生型MSCs中测量IL-10的mRNA水平。数据显示表明 C17 中 iL-10 的 mRNA 和蛋白质水平远高于野生型和 C16(图2D)。基因组编辑程序并未影响 MSC 的表型，包括细胞表面标志物的表达(图 2E)和分化能力(图2F)。在基因组编辑之前也得到了证实(补充图 1)。此外，这也通过将另一个免疫抑制基因 IL-37 插入同一位点来验证[25](补充图 2)。

我们在这里证明了 PK-T20 方法可用于表征细胞数范围为 10 到 1000 的 MSC 单克隆。通过使用该方法，我们成功地建立了在 AASV1 位点过度表达 IL-10 或 IL-37 表达的 MSC 单克隆，可能具有偏倚承诺在未来的治疗应用。

图 1. 直接细胞裂解和 PCR 的方法比较。将间充质干细胞接种到 96 板上，每孔 1、10、102 和 103 个细胞。过夜孵育后，用指定的细胞裂解方法直接裂解细胞。 I：直接裂解法; 二：PK法; 三：PK-T20法;IV：PK-SDS-1法; V：PK-SDS-0.5法; VI：PK-SDS-0.1法; VII：NaOH法; VIII：KOH法; I X：NL法; X：NaOH-T20法; X I：PK-Igepal-T20法; XII：Amp(Extract-N-Amp™ Blood PCR Kits)方法。使用 2 x PCR 混合物(Thermo Scientific)进行 PCR，含或不含 0.1% BSA 和 1% PVP40。

M：DNA; 箭头显示 1.0 或 1.5 kb 的 DNA 大小。

图 2. 将 IL-10 插入 AASV1 位点的目标。 (A) 供体和 gRNA 结构。 (B) 通过放大左臂对基因组编辑的间充质干细胞 (MSC) 单克隆进行 PCR 表征。箭头显示预测的 PCR 产物大小。 (C) 通过放大右臂对基因组编辑的 MSC 菌落进行 PCR 表征。箭头显示预测的 PCR 产物大小。 (D) 没有供体插入的菌落 16 (C16)、正确插入的菌落 17 (C17) 和野生型 MSCs (NC) 中 IL-10 的 mRNA 和蛋白质水平。 (E) MSC 单克隆 C17 通过流式细胞术用 MSC 标志物进行表征。 (F) MSC 单克隆 C17 可以分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞。

M：DNA梯; 箭头显示 750 bp、1.0 或 2 kb 的 DNA 大小。